310 10*1mm ステンレス鋼コイル状チューブの化学成分、スピドロインの N 末端ドメインはアミロイド原線維に基づいてヒドロゲルを形成し、タンパク質固定化のプラットフォームを提供します。

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仕様

310 10*1mm ステンレス鋼コイル チューブ サプライヤー

化学組成

機械的性質

組換えクモ糸タンパク質 (スパイダー シルク タンパク質) には、新しい生体材料の開発において多くの潜在的な用途がありますが、多峰性で凝集しやすい性質があるため、入手が難しく、使用も簡単です。今回我々は、組換えミニチュアスピドロインタンパク質、そして重要なことに、N末端ドメイン（NT）自体が37℃で自立型の透明なハイドロゲルを急速に形成することを報告する。NTと緑色蛍光タンパク質またはプリンヌクレオシドホスホリラーゼからなる融合タンパク質は、完全に機能する融合タンパク質を形成します。ヒドロゲル。我々の結果は、組換えNTおよび融合タンパク質が高い発現収率をもたらし、透明性、架橋なしのゲル化、活性タンパク質の高密度での直接固定化などの魅力的な特性をハイドロゲルに与えることを示しています。
クモには 7 種類もの絹糸腺があり、それぞれが特定の種類の絹糸を生成します。7 つのシルク種はすべて、長さ約 6000 残基のクモ糸タンパク質 (スピドロイン) で構成されており、球状の N 末端ドメインと C 末端ドメイン (NT および CT) に囲まれた大きな中央反復領域を含んでいます 1,2。最も広く研究されている種類のシルクである一次膨大部は、一次膨大部腺によって生成されます。この腺では、上皮細胞の単層がスピドロインタンパク質を合成し、スピドロインタンパク質を腺の内腔に分泌します。スピドロインタンパク質は、非常に高濃度 (30 ～ 50% w/v) で可溶性の形態 (ドーピング) で存在します 3,4。腺内の主要な膨大スピドロインタンパク質の組織と立体構造については議論されていますが、ほとんどの実験的証拠は、一般的に螺旋状および/またはランダムな螺旋状立体構造およびミセルまたはラメラ構造の存在を示しています5、6、7、8、9、10。反復ドメインは絹繊維の機械的特性を調節し、β シート ナノ結晶と非晶質構造を形成します 11、12、13、14、15 が、末端ドメインは絹糸腺に沿った状態の変化に応じて絹繊維を調節します 16、17、18。シルク形成を制御することにより、19. 末端ドメインは進化的に保存されており、その機能はすべてのスピドロインタンパク質に共通している可能性があります 2、20、21。腺を通過する間、スピドロインの pH は約 7.6 から < 5.716 に低下し、徐々に狭くなる管を通る運動によって媒介されるせん断と伸張によって増加します。溶液中では、CT は α ヘリックス構成平行二量体 17 ですが、低い pH とせん断力に応答して CT は展開して β 層を切り替えます 16, 17。これにより、Convert 16 の繰り返し領域で β 層が誘発される可能性があります。NT は単量体です。この条件は腺の内腔の条件を反映し、スピドロインの溶解度を媒介しますが、pHが低下すると、多くのカルボン酸側鎖のプロトン化によりpKaが約6.5のNTの二量体化が起こり、それによってNTが安定化し、スピドロインが大きく固定されます。量。ネットワーク16、18。したがって、NT はフィラメント形成において重要な役割を果たし、コーティング内のモノマーからファイバー内のダイマーに変化します 23、24、25。NT は、これまでに研究されたすべての条件下で可溶性が高く、らせん状を維持します 16、18、19、20、26、27、28、29。このことが、異種タンパク質の生産のための溶解性を高める標識としての開発のきっかけとなりました。
組換えミニ スパイダー シルク タンパク質は、1 つの NT、1 つのショート リピート領域、1 つの CT、および精製用の His6 タグ (His-NT2RepCT) で構成されており、天然のクモ シルク タンパク質と同様に水性緩衝液に可溶性であり、カイコグモの本来の重要な特性を模倣しています。 。25.31の範囲。His-NT2RepCT は、pH 8 の可溶性コーティングを pH 525、32、33、34、35 の水浴中に押し出す生体模倣機械を使用して連続繊維に紡糸することができます。His-NT2RepCTを発現する大腸菌のバイオリアクター発酵とその後の後処理により、精製後に>14 g/Lの収量が得られました。His-NT2RepCT の高収率、高溶解度、酸性条件に対する適切な応答はすべて NT23、25、34 によるものと考えられます。
今回我々は、タンパク質溶液を37℃でインキュベートすることにより、NT単独を含む組換えスピドロインタンパク質から透明なハイドロゲルが迅速に形成されることを報告する。チオフラビン T 蛍光 (ThT)、フーリエ変換赤外分光法 (FTIR)、核磁気共鳴分光法 (NMR)、透過型電子顕微鏡 (TEM) を使用して、NT タンパク質とマイクロスパイダータンパク質がβシートとアミロイド様原線維に構造変化することを発見しました。ゲルが形成されるとき。さらに、NT と緑色蛍光タンパク質 (GFP) またはプリン ヌクレオシド ホスホリラーゼ (PNP) の融合タンパク質は、完全に機能する融合フラグメントを含むヒドロゲルを形成します。異種宿主におけるハイスループット発現は、生理学的条件下でのヒドロゲルの迅速な形成と相まって、操作された機能を有するヒドロゲルの費用効率の高い生産の可能性を切り開きます。
報告されているほとんどの組換えスピドロインタンパク質 36 とは異なり、His-NT2RepCT は pH 8 の Tris-HCl 緩衝液中で安定であり、沈殿することなく最大 500 mg/mL まで濃縮できます 25。したがって、このタンパク質が37℃でインキュベートすると、光学的に透明な自立ヒドロゲルを急速に形成することを発見して我々は驚いた（図1b～d）。さらなる研究により、His-NT2RepCTのゲル化は広範囲のタンパク質濃度（10〜300 mg/mL）で発生し、この濃度はゲル化時間と逆相関することが示されました（図1cおよび補足図1）。His-NT2RepCT のどの部分がヒドロゲル形成を媒介するかを調べるために、フラスコ反転アッセイを使用して各ドメインを個別に、およびさまざまな組み合わせで調べました (図 1a、b)。沈殿した2Repを除き、試験した組換えスピドロインのすべての画分は1時間未満でゲルを形成しました（タンパク質濃度300 mg/mL）（図1b）。これは、NT と CT が単独で、組み合わせて、または反復と結合して 37℃ でゲル化する可​​能性があり、His6 タグがこのプロセスに重大な影響を及ぼさないことを示唆しています。NT は可溶性が高く安定したタンパク質であるという一般的な概念、および組み換えスピドロイン ハイドロゲルに関する以前の報告では、ゲル化効果がリピート領域および/または CT の構造変化に起因すると考えられているため、NT 自体もその可能性があります。ゲル化の発見は予想外でした。補足表 1) 37、38、39。 注目すべきことに、NT は 300 mg/mL 以上の濃度で 10 分以内にすでにゲル化しました (図 1c)。さまざまな濃度の NT を使用したバイアル反転実験では、50 mg/mL を超える場合、NT 溶液は対応する濃度の His-NT2RepCT よりも速くゲル化することが示されました (w/v、図 1c)。
この研究で研究されたさまざまなスピドロイン構築物の概略図。b バイアルを反転して確認した、さまざまな組換えスピドロインタンパク質 (300 mg/mL) の 37 °C でのゲル化時間。インキュベートせずに直ちに CT ゲル (<300 mg/mL)、2Rep 沈殿 (300 mg/mL、5 mm スケール)。c 37℃での示されたタンパク質濃度でのHis-NT2RepCTおよびNTのゲル化時間。d His-NT2RepCT および NT ハイドロゲルの写真。それぞれスパイダーとその下に印刷された「NT」の文字 (両方とも 200 mg/mL、スケール バー 5 mm)。
さまざまな組換えスピドロインタンパク質によって形成されたヒドロゲルはわずかに色が異なり、肉眼で観察するとさまざまな透明度が示されます（図1b）。NT ゲルは非常に透明ですが、他のゲルは不透明になります。円筒形チューブにキャストされた His-NT2RepCT および NT ゲルは、そのままの状態で型から取り出すことができました (図 1d)。
組換えスピドロインタンパク質のゲル化を引き起こすことが現在判明している条件下で、天然のクモ糸コーティングがゲル化するかどうかを試験するために、スウェーデン橋グモ (Larinioides sclopetarius) の大膨大部腺からコーティングを収集した。コーティングは、50 mg/mL（測定された乾燥重量に基づく）で20 mM Tris-HCl緩衝液中に保存されましたが、37℃で21日間のインキュベーション中にゲル化は観察されませんでした（補足図2a）。
これらのゲルを定量化するには、レオロジー測定を使用してゲル化プロセスを研究し、全体的な機械的特性を決定します。特に、高温での貯蔵弾性率（弾性）を監視すると、コーティングの粘弾性特性だけでなくゲル化温度に関する情報も得られます。温度上昇実験 (天然シルク原液を使用した以前の研究に基づいて、25 ～ 45 ℃で 1 ℃/分を使用) 40,41 は、His-NT2RepCT および NT 溶液の貯蔵弾性率が温度の上昇とともに増加することを示しました。増加しました（図2および補足図3）。特に、NT モジュールは His-NT2RepCT と比較してより低い温度で増殖を開始しました。これは、NT を His-NT2RepCT と 37℃で直接インキュベートした場合に観察されたより速いゲル化時間と一致しています (図 1)。その後の温度低下後、貯蔵弾性率はより低い値に戻らず、損失弾性率を超えたままとなりました（補足図3を参照）。これは、熱的に不可逆的な安定したゲル化を示しています。ゲル化後の濃度 100 ～ 500 mg/mL の His-NT2RepCT ハイドロゲルの最終弾性率は 15 ～ 330 kPa の範囲であり、NT ハイドロゲル (100 ～ 500 mg/mL) の最終弾性係数は 2 ～ 1400 の範囲でした。 kPa (図 2 および完全なランプ データ) 補足図 3 を参照)。
a His-NT2RepCT (300 mg/mL) および b NT (300 mg/mL) の振とう測定中の温度変化。矢印は温度の傾向を示し、ストレージ モジュール データの明るい陰影は、メーカーが指定した機器のトルク値よりも低いトルク値でのテストを示しています。これがノイズ増加の原因です。c 温度上昇後の His-NT2RepCT および NT のエンドモジュール蓄積 (100、300、および 500 mg/mL)。すべてのモジュールの読み取り値は 0.1 Hz の周波数で取得されます。
ゲル化に関連する構造変化を調査するための可能性のある方法として、37°C​​でのゲル化前後のHis-NT2RepCTおよびNTのFTIRスペクトルを記録しました（図3a、b）。予想どおり、His-NT2RepCT および NT 溶液のスペクトルは、1645 cm-1 に顕著なバンドを持つ、α-ヘリックス/ランダムコイル二次構造を示すタンパク質に対応しました。どちらのヒドロゲルでも、ゲル化により中央の I バンドの約 1617 cm-1 と 1695 cm-1 に 2 つのアームが形成され (図 3a、b)、これは逆平行βシート構造の形成を示しています。これらの変化は、それぞれの二次微分スペクトルと差分ゲル化スペクトルでも明確に見ることができます（補足図4b）。NT β 層の 2 つのバンドは His-NT2RepCT のバンドよりも顕著であり、NT ハイドロゲル中の β 層バンドの総含有量が NT2RepCT ハイドロゲルよりも高いことを示しています。
a His-NT2RepCTおよびb NT（両方とも500 mg/mL）の37℃でのインキュベーション前（溶液）および後（ゲル）のFTIR吸収スペクトル。c 再懸濁した 50 mg/ml NT2RepCT ゲルおよび d NT の TEM 画像。スケールバーは200nm。e His-NT2RepCT および NT ハイドロゲルの繊維直径。n = 100 測定原線維、p < 0.0001。エラーバーは標準偏差を示します。誤差範囲の中心が平均値です。統計分析には対応のない t 検定 (両側) を使用しました。f 振盪せずに 37 °C でのさまざまな組換えスピドロインタンパク質 (100 mg/mL) の ThT 蛍光。g 0％、5％、10％、および20％の種子を含む100 mg/mL NTゲルからのNT（100 mg/mL）接種実験。
透過型電子顕微鏡（TEM）を使用したゲルの分析により、ヒドロゲルがアミロイド様フィブリルから構成されていることが示されました（図3c、3d）。NTで形成されたフィブリルは伸長し（直径5〜12 nm）、分岐していませんでしたが、His-NT2RepCTフィブリルは長さが短く、直径が大幅に広かった（7〜16 nm）（図3e）。これらの結果により、チオフラビン T (ThT) アッセイを使用して線維症の動態を追跡することができました。すべての組換えスピドロインタンパク質について、サンプルを37℃でインキュベートすると蛍光シグナルが増加しました（図3f、補足図5a）。この発見と一致して、ゲル化条件下でのNTおよびHis-NT2RepCTの顕微鏡検査により、ThT陽性凝集体の顕著な局所的蓄積はなく、ThT蛍光の均一な増加が明らかになりました（補足図5b、c）。ThT 陽性フィブリルの形成には NT および His-NTCT の濁度の増加は伴わなかった（補足図 5d）。これは、ゲル内のフィブリルのネットワークがゲルの透明性を損なうことなく形成できることを意味します。少量のあらかじめ形成された原線維を添加することによる播種は、一部のアミロイドの原線維形成を大幅に加速する可能性があります42、43、44。ただし、NT ヒドロ凝固剤の溶液に 5%、10%、または 20% (w/w) NT を追加します。シーディング効果（図3g）。おそらくこれは、ヒドロゲル内のフィブリルが比較的固定されており、シードとして使用できないという事実によるものです。
高温における組換えスピドロインタンパク質の予期せぬ挙動は、ゲル形成に関連する構造変化を特定するためのさらなる核磁気共鳴（NMR）分光法研究を促しました。37℃で経時的に記録されたHis-NT2RepCT溶液のNMRスペクトルは、CTがまだ部分的に折り畳まれている一方、NTおよび2Repシグナルが消失していることを示し（図4a）、His-NT2RepCTの形成を部分的に制御しているのは主にNTと2Repであることを示唆しています。 NT2RepCTハイドロゲル。CT シグナルも元の強度の 20% に減衰しました。これは、CT もほとんどが固定され、ヒドロゲル構造に組み込まれていることを示唆しています。プレインキュベートしたサンプルと同様に可動性があり、溶液 NMR で観察される CT のより小さい部分では、おそらく His-NT2Rep の結合部分の固定化が難しいため、スペクトルには最初の 10 個の構造残基のシグナルが欠けています。ヒドロゲルの状態 -NT2RepCT の NMR スペクトルにより、α ヘリックスと β 層が主に存在し、程度は低いがランダム コイル構造が明らかになりました (図 4b)。NTにのみ存在するメチオニン残基の化学シフト分析により、このドメインがβシート構造に変換されていることが示された。溶液中のNTの時間依存スペクトルは信号強度の均一な減少を示し（図4c）、NTヒドロゲルの固体NMRはNT残基のほとんどがβシート構造に変換されたことを示しました（図4d）。2Rep は凝集する傾向があるため、その立体構造を個別に決定することはできませんでした。ただし、NTCTヒドロゲルとHis-NT2RepCTヒドロゲルの固体NMRスペクトルは非常によく似ており（図4b、補足図6b）、2RepがHis-NT2RepCTヒドロゲルの構造部分にほとんど寄与していないことを示唆しています。CTヒドロゲルの場合、αヘリックス、βシート、およびランダム螺旋二次構造が存在することが判明した（補足図6d）。これは、CT の一部の部分は α ヘリックスのままであり、他の部分は β シートになることを示唆しています。したがって、NMR 分光法の結果は、NT がヒドロゲル形成に重要であり、2Rep および CT と融合すると β シート構造に変換することを示唆しています。これと一致して、我々は最近、アミロイド空間ジッパーがNTドメインの5つのヘリックスすべてに形成される可能性が高いことを発見し、Waltzアルゴリズムはヘリックス1のアミロイド生成領域を予測しました（図4e）。
37℃でのインキュベーション前（青）および19時間後（赤）の15N-HSQC 10 mg/mL His-NT2RepCT溶液の2Dスペクトル。赤色のスペクトルの個々のクロス ピークと青色のスペクトルの F24、G136、ポリ A は、一文字のアミノ酸記号と残基番号で示されています。挿入図は、NT、2Rep、および CT ドメインから選択された残基のシグナル強度の時間依存性を示しています。b His-NT2RepCTヒドロゲルの固体高周波（RFDR）スペクトル。RFDR スペクトルで観察された Cα/Cβ 残基の相関関係は、モデルペプチドの化学シフトと統計 82,83 およびそれらの二次構造から導かれた値との比較によって決定されました。SSB – 回転側波帯。c 37°Cで36時間インキュベート中の15N-HSQC 10 mg/mL NT溶液の一次元スペクトル。挿入図は、体積強度対時間を示しています。d NTヒドロゲルの固体RFDRスペクトル。RFDR スペクトルで観察される Cα/Cβ 残基とその二次構造の相関関係が示されています。e Zipper データベース (https://services.mbi.ucla.edu/zipperdb/) の NT45.79 細動傾向プロファイルに基づいています。ヘキサペプチドの空間雷シフトウィンドウのロゼッタエネルギーは、kcal/mol で示されます。赤いバーは、線維化傾向が高いヘキサペプチドを示します (-23 kcal/mol 未満のロゼッタ エネルギー、点線の下)。緑色のバーは、ロゼッタ エネルギーがしきい値を超えているため、立体ジッパーを形成する可能性が低いフラグメントを示します。プロリンを含むフラグメントは分析から除外されました (カラムなし)。四角は、Waltz アルゴリズム 81 (https://waltz.switchlab.org) によって予測されたアミロイドーシスの領域を示します。NTのアミノ酸残基の配列が一番上にあり、β二次構造（固体NMR分光法で決定）に見られる残基の種類が赤色で示されています。5 つの NT α-ヘリックスの位置は (H1-H5)28 として指定されます。
pH <6.5 では、HT は二量体化し、熱または尿素による変性に対して耐性があります 18。NT の二量体化と安定性がゲル化にどのように影響するかを解明するために、100 mg/ml NT を含む溶液をバイアル反転テストを使用して pH 8、7、および 6 に制御しました。pH 8および7でインキュベートしたNTサンプルは37℃で30分後にゲル化しましたが、pH 8のゲルは透明なままでしたが、pH 7のゲルは目に見える沈殿を示しました（図5a）。対照的に、pH 6 の HT を含む溶液はゲルを形成せず、37℃で 20 分後に大きな沈殿が見られました。これは、二量体自体、および/または単量体と比較してその高い安定性がゲル化を防ぐことを示唆しています。NT は 200 mg/ml で可溶性であり 27、熱変性後に容易にリフォールディングし、より低い値でも α ヘリックスを保持することが報告されているため、pH 7 および 6 での NT の沈殿物の形成は予想されませんでした。これらの矛盾について考えられる説明は、以前に報告された実験が室温以下、または比較的低いタンパク質濃度で実施されたことである16、18、19。
37℃でのインキュベーション後の、pH 8、7、6および154 mM NaCl (pH 8)でのNTバイアル反転試験(100 mg/mL)。b 154 mM NaFおよび154 mM NaClをそれぞれ含む場合と含まない場合のNT CDスペクトル。222 nm でのモル楕円率は、自然なひだの割合に変換されます。c NT 反転アッセイ (100 mg/mL) NT* (37 °C および 60 °C)、NTA72R (37 °C)、および His-NT-L6 (37 °C および 60 °C)。d NT変異体NT*、NTA72R、およびHis-NT-L6のCDスペクトル。222 nm でのモル楕円率は、自然なひだの割合に変換されます。e NTFlSp、NTMiSp、および還元された NTMiSp (100 mg/mL) の反転テスト。スケールバーは5mm。f NT、NTFlSp、NTMiSp、および還元型NTMiSpのCDスペクトル。222 nm でのモル楕円率は、自然なひだの割合に変換されます。25 °C および 95 °C での完全な NT スペクトルを補足図 8 に示します。
生理的塩濃度は、NT サブユニット間の静電相互作用と、pH18 を下げるための NT 移動の二量体化を決定します。154 mM NaClとNaFの存在がそれぞれ実際にゲル化を阻害し（図5a、b、補足図2b）、これらの塩がNTモノマーの熱安定性を増加させることを発見しました（図5b、補足図8）。 。また、二量体化ではなく安定性の向上によりゲルの形成が防止されることも示唆されています。
タンパク質の二量体化の役割とゲル化における安定性をさらに調査するために、我々は、低 pH28.30 でも単量体のままである 2 つの変異体、NT* および NTA72R を使用しました。NT* は、モノマーの見かけの双極子電荷分布が平坦化された二重電荷反転変異体であり、これにより二量体化が防止され、モノマーの安定性が大幅に向上します。NTA72R は荷電双極子ですが、Arg 置換 Ala は二量体境界に位置しているため、突然変異は二量体化に必要なサブユニット相互作用を妨げます。37℃でのインキュベーションでは、NT*はヒドロゲルを形成しませんでしたが、NTA72Rは15分間不透明なゲルを形成しました（図5c）。NT*とNTA72Rは両方とも二量体化できませんが、モノマー安定性が異なるため（図5d）、これらの結果は、高い熱力学的安定性がNTのゲル化を防ぐことを強く示唆しています。これは、HT*が高温で不安定になるとゲルを形成するという事実によっても裏付けられます（60℃で8分後、図5c）。NT中の高含量のメチオニンがその自然な折り畳みを液化し、6つのMetからLeuへの置換物(ここではHis-NT-L6と呼ぶ)がNT46モノマーを強力に安定化することが以前に示されている。構造の柔軟性がNTゲルの形成に必要であるという仮定に基づいて、His-NT-L6安定変異体は37℃でゲル化しないことがわかりました（図5c、d）。しかし、His-NT-L6も60℃で60分間インキュベートするとゲルを形成しました（図5c）。
NT が β シート構造に変換し、ヒドロゲルを形成する能力は、スピドロインの NT ドメインのすべてではなく一部に当てはまるようです。さまざまなシルクタイプとクモ種である Trichonephila clavipes (NTFlSp) からの NT は、メチオニン含有量が比較的低く、熱安定性が高いにもかかわらず、ゲルを形成しました (図 5e、f、および補足表 2)。対照的に、熱安定性が低く、メチオニン含有量が高い、Araneus ventricosus 由来の小瓶状タンパク質スピドロイン (NTMiSp) からの NT はヒドロゲルを形成しませんでした (補足表 2 および図 5e、f)。後者は、分子内ジスルフィド結合の存在と関連している可能性があります 29,47。一貫して、NTMiSpのジスルフィド結合が還元されると、37℃で10分間インキュベートした後にヒドロゲルが形成されました（図5e）。結論として、構造の柔軟性は、NT からゲルを形成するための重要な基準ではありますが、唯一の基準ではないことに注意する必要があります。関連する可能性のあるもう 1 つの要因は、アミロイド原線維を形成する傾向であり、ジッパー データベースと Waltz アルゴリズムを使用した分析では、ゲルを形成する能力とアミロイド生成領域の存在、および予測される領域の範囲との間の相関関係を示しました。立体的なジッパーを形成します。相関関係がありました (補足表 2 および補足図 9)。
好ましい条件下でフィブリルを形成し、ゲルを形成するNTの能力により、NTが他のタンパク質断片と融合しても、融合パートナーの完全な機能を備えたゲルを形成できるという仮説が立てられました。これをテストするために、NT の C 末端に緑色蛍光タンパク質 (GFP) とプリン ヌクレオシド ホスホリラーゼ (PNP) をそれぞれ導入しました。得られた融合タンパク質は、これまでに示されている内容と一致して、非常に高い最終収量（His-NT-GFP および His-NT-PNP についてそれぞれ 150 mg/L および 256 mg/L 振盪フラスコ培養）で大腸菌内で発現されました。 NT に融合された他のタンパク質については参考文献。30. His-NT-GFP (300mg/mL) および His-NT-PNP (100mg/mL) 融合タンパク質は、37℃で 2 時間および 6.5 時間後にゲルを形成しましたが、重要なことに、GFP 画分は変化しませんでした。ゲル化後に観察され、ゲル化後も初期蛍光強度の>70%が残っています（図6a）。his-NT-PNP 溶液およびゲル中の PNP 活性を測定するには、純粋な調製物の酵素活性がゲル化濃度でのアッセイの検出範囲外であったため、融合タンパク質を NT で希釈する必要がありました。0.01 mg/mL His-NT-PNP と 100 mg/mL NT を含む混合物で形成されたゲルは、プレインキュベートされたサンプルの初期酵素活性の 65% を保持していました (図 6b)。ゲルは測定中無傷のままでした（補足図10）。
a 可視光および紫外光下での His-NT-GFP (300 mg/mL) および His-NT-GFP ハイドロゲル (300 mg/mL) を含む逆さまバイアルのゲル化前後の相対蛍光強度。点は個々の測定値 (n = 3) を示し、エラーバーは標準偏差を示します。平均値はエラーバーの中央に表示されます。b PNP活性は、NT（100 mg/ml）と、0.01 mg/ml his-NT-PNPおよび100 mg/ml新台湾ドルを含む混合物からなる溶液およびゲルを使用した蛍光分析によって得られました。挿入図は、His-NT-PNP を含むヒドロゲルを含む逆さまのバイアルを示しています (5 mm スケール バー)。
ここでは、タンパク質溶液を 37°C でインキュベートすることによる、NT およびその他の組換えスピドロインタンパク質からのヒドロゲルの形成について報告します (図 1)。我々は、ゲル化がαヘリックスのβ層への変換とアミロイド様原線維の形成に関連していることを示します（図3および4）。NT はコイル状の球状の 5 螺旋束であり、200 mg/mL を超える濃度で 4℃、数日間にわたって非常に高い溶解性と高い安定性を示すことが知られているため、この発見は驚くべきものである 27。さらに、NT は、μM 単位の低タンパク質濃度での熱変性後に容易にリフォールディングします。私たちの結果によると、原線維の形成には、10 mg/mL を超えるタンパク質濃度とわずかに高い温度の組み合わせが必要です (図 1)。これは、生理学的条件下での熱変動により部分的に折りたたまれた状態にある球状に折りたたまれたタンパク質からアミロイド原線維が形成され得るという考えと一致している 48 。この変換を受けるタンパク質の例には、インスリン 49,50、β2-ミクログロブリン、トランスサイレチン、およびリゾチーム 51,52,53 が含まれます。NTは天然の状態ではαヘリックスですが、ポリペプチド鎖の約65％は立体ジッパー形成に適合します（図4e） 45 。モノマーは動的に移動するため 46、適度に高い温度でこれらの潜在的なアミロイド形成領域を露出させることができ、高濃度の総タンパク質ではアミロイド原線維形成の臨界濃度に達する可能性があります 54。この推論に従って、スピドロイン濃度とゲル化時間の間に負の相関関係があることがわかりました（図1c）。単量体NT立体構造が突然変異（NT*、His-NT-L6）または塩の添加によって安定化されている場合、ゲル化を防ぐことができます。ハイドロゲルの形成 (図 5)。
ほとんどの場合、アミロイド原線維は沈殿として溶液から消えますが、特定の条件下ではヒドロゲルを形成する可能性があります55、56、57。ヒドロゲル形成フィブリルは通常、高いアスペクト比を持ち、分子の絡み合いを通じて安定した三次元ネットワークを形成します 55,58 。これは我々の結果と一致しています。in vitro でのハイドロゲル形成では、タンパク質は、たとえば有機溶媒、高温 (70 ～ 90 ℃) および/または低 pH (1.5 ～ 3.0) にさらすことによって、完全または部分的に折りたたまれることがよくあります 59,60,61,62。ここで説明するスピドロイン ハイドロゲルは過酷な処理を必要とせず、またハイドロゲルを安定化するための架橋剤も必要としません。
スピドロインリピートと量子ドットは、シルク紡糸中にβシートスイッチングを受けると思われ、ヒドロゲルを形成することが以前に報告されています。私たちの調査結果と比較して、インキュベーション時間および/またはインキュベーション温度はそれぞれ大幅に長いかまたは高く、得られたヒドロゲルは多くの場合不透明でした（図7および補足表1）37、38、63、64、65、66、67、68 、69. ゲル化時間が速いことに加えて、NT ハイドロゲル >300 mg/mL (30%) は、記載されている他のすべての組換えスパイダーシルクタンパク質ハイドロゲルや、ゼラチン、アルギン酸塩 (2%)、寒天 (0.5%) などの天然ハイドロゲルよりも優れた性能を示しました。 ）とコラーゲン。(0.6%) (図 7 および補足表 1 および 3)37,39,66,67,68,69,70,71,72,73,74。
この研究におけるヒドロゲルのゲル化時間と弾性率は、他のスピドロインベースのヒドロゲルおよび選択された天然ヒドロゲルと比較されました。ゲル化条件の説明とともに参考文献を示します。APS 過硫酸アンモニウム、室温。データ37、38、39、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74。
クモは、保管中にスピドロインがゲル化するのを防ぐ方法を開発したようです。絹糸腺のタンパク質濃度が高いにもかかわらず、末端ドメインに関連する大きなリピート領域は、絹糸腺内の NT および CT の見かけの濃度がこの研究の境界で約 10 ～ 20 mg/ml に相当することを意味します。インビトロで観察されるヒドロゲル形成に必要です。さらに、絹糸腺と同様に、同様の濃度の塩 16 が NT を安定化しました (図 5b)。NT コンフォメーションは大腸菌の細胞質ゾルで研究されており、in vitro で調べた場合よりもしっかりと折り畳まれていることが判明し、塩または他の要因が in vivo での凝集を妨げていることをさらに示しています。ただし、NT が β シート原線維に変換する能力はフィラメント形成にとって重要である可能性があり、今後の研究で調査される必要があります。
この研究で観察されたNTアミロイド様フィブリルおよびヒドロゲル形成の新たな側面に加えて、この現象が生物工学および生物医学に応用できる可能性があることも示しました（図8）。概念実証として、NT を GFP または PNP と組み合わせ、融合タンパク質が 37 °C でインキュベートしたときにもヒドロゲルを形成すること、および GFP および PNP 画分がゲル化後もその活性を大部分保持していることを示しました (図 6)。ヌクレオシド ホスホリラーゼはヌクレオシド類似体の合成の重要な触媒であり 75、このため私たちの発見はバイオ医薬品産業に関連したものとなっています。有利な条件下で透明なハイドロゲルを形成する融合タンパク質を発現するという概念により、酵素の固定化、薬物放出の制御、組織工学などの幅広い用途に有利な特性を備えた機能化ハイドロゲルの作成が可能になります。さらに、NT および NT* は効率的な発現マーカーです 30。これは、NT およびその変異体が可溶性融合タンパク質のハイスループット生産と、その後の 3D ハイドロゲルでの固定化された標的タンパク質の作成に使用できることを意味します。
NT は可溶性で、α-ヘリックスであり、低濃度 (μM) および 37°C で安定です。同じ温度で、濃度が増加すると (>10 mg/ml)、NT はアミロイド様原線維からなるゲルを形成します。NT 融合タンパク質は、完全に機能する融合フラグメントを含む原繊維ゲルも形成するため、NT を使用してさまざまなタンパク質を 3D ハイドロゲルに固定化できます。下: NT (PDB: 4FBS) およびファイバーネットワークと関連タンパク質構造の図 (想定されており、縮尺通りに描かれていない、GFP PDB: 2B3Q、10.2210/pdb2B3Q/pdb、PNP PDB: 4RJ2、10.2210/pdb4RJ2/pdb)。
構築物(アミノ酸配列を含む完全なリストについては補足表4を参照)をプラスミドpT7にクローン化し、大腸菌BL21(DE3)に形質転換した。改変プラスミドを含む大腸菌を、カナマイシン（70 mg/l）を補充したルリアブロスに接種し、30℃、250 rpmで一晩増殖させた。次いで、培養物をカナマイシンを含むＬＢ培地に１／１００植菌し、３０℃、１１０ｒｐｍでＯＤ６００が０．８に達するまで培養した。NMR 研究では、同位体によるタンパク質標識のために、2 g の D-グルコース 13C (Aldrich) と 1 g の塩化アンモニウム 15N (Cambridge Isotope Laboratories, Inc.) を含む M9 最少培地で細菌を増殖させました。温度を摂氏 20 度に下げ、0.15 mM イソプロピルチオガラクトピラノシド (最終濃度) でタンパク質発現を誘導します。一晩タンパク質を発現させた後、細胞を7278×g、4℃で20分間回収した。細胞ペレットを20 mM Tris-HCl、pH 8に再懸濁し、さらに使用するまで凍結した。解凍した細胞を、細胞破壊装置（TSシリーズ機械、Constant Systems Limited、英国）を30 kPaで使用して溶解した。次に、溶解物を 4℃、25,000 g で 30 分間遠心分離しました。NTMiSp の場合、ペレットを 2 M 尿素、20 mM Tris-HCl、pH 8 に再懸濁し、2 分間超音波処理し (2 秒オン/オフ、65%)、その後 25,000 xg、4℃で再度遠心分離しました。 30分。上清を Ni-NTA カラムにロードし、20 mM Tris-HCl、2 mM イミダゾール、pH 8 で洗浄し、最後にタンパク質を 20 mM Tris-HCl、200 mM イミダゾール、pH 8 で溶出しました。 NTCT、トロンビン消化により、His と NT の間に部位 (ThrCleav) が導入されます。トロンビン切断部位は、His-NT-ThrCleav-2Rep (2Rep を生成)、His-チオレドキシン-ThrCleav-NT (NT を生成)、His-チオレドキシン-ThrCleav-CT (CT を生成)、His-チオレドキシン-ThrCleav-NT にも存在します。 。* (NT* を生成)、His-チオレドキシン-ThrCleav-NTA72R (NTA72R を生成)、His-チオレドキシン-ThrCleav-NTFlSp (NTF1Sp を生成)、および His-硫黄レドキシン-ThrCleav-NTMiSp (NTMiSp を生成)。構築物をトロンビン（１：１０００）で消化し、６〜８ｋＤａの分子量閾値を有するＳｐｅｃｔｒａ／Ｐｏｒ透析膜を使用して、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８で４℃で一晩透析した。透析後、溶液は Ni-NTA カラムにロードされ、目的のタンパク質を含む流出液が収集されます。タンパク質濃度は、メーカーのプロトコールに従ってブラッドフォードアッセイを使用した NTF1Sp を除く各タンパク質の吸光係数を使用して 280 nm での UV 吸光度を測定することによって決定されました。純度は、SDS ポリアクリルアミド (4 ～ 20%) ゲル電気泳動およびクーマシー ブリリアント ブルー染色によって決定されました。タンパク質は、遠心分離フィルター (VivaSpin 20、GE Healthcare) を使用して、4000 xg、分子量カットオフ 10 kDa、20 分サイクルで濃縮しました。
タンパク質溶液を解凍し、150 μl を慎重にピペットで取り、1 ml の透明なセプタムバイアル (8 x 40 mm Thermo Scientific) に移します。チューブに蓋をし、蒸発を防ぐためにパラフィルムで密封した。サンプル (n = 3) を 37°C または 60°C でインキュベートし、定期的に反転してゲル化を観察しました。ゲル化しないサンプルは少なくとも 1 週間インキュベートしました。10 μM タンパク質あたり 10 mM DTT を使用して NTMiSp ジスルフィド結合を減少させます。天然クモ糸コーティングのゲル化を分析するために、スウェーデンブリッジスパイダーを切断し、２つの主要な切断腺を２００μｌの２０ｍＭトリス－ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８）中に置き、切断してコーティングを腺から分離させた。。腺の内容物を緩衝液に溶解し、乾燥重量の測定用に 50 μl (開いたバイアルを 60 °C で恒量になるまでインキュベートすることによる)、37 °C でのゲル化用に 150 μl を使用します。
測定形状/ツールは、上部直径 20 mm、ギャップ 0.5 mm の平行プレートを使用したステンレス鋼で作られています。ステンレス鋼底ペルチェ プレートを使用して、サンプルを 25 °C から 45 °C まで加熱し、1 分あたり 1 °C の速度で 25 °C に戻します。振動測定は、周波数 0.1 Hz、材料の線形粘弾性領域で、100 mg/mL および 300 ～ 500 mg/mL のサンプルに対してそれぞれ 5% および 0.5% のひずみで実行されました。蒸発を防ぐためにカスタム湿度チャンバーを使用してください。データは Prism 9 を使用して分析されました。
室温で 800 ～ 3900 cm-1 の赤外線 (IR) スペクトルを収集します。ATR デバイスと分光計を通る光路は、実験前および実験中に乾燥した濾過空気でパージされます。溶液 (スペクトル内の水吸収ピークを最小限に抑えるため 500 mg/mL) を結晶上にピペットで滴下し、測定前にゲル (500 mg/mL) を形成し、その後結晶に移しました (n = 3)。1000 回のスキャンを解像度 2 cm-1、ゼロデューティサイクル 2 で記録しました。二次導関数は OPUS (Bruker) を使用し、9 ポイントの平滑化範囲を使用して計算されました。スペクトルは、F. Menges「Spectragryph – Optical Spectroscopy Software」を使用して、1720 ～ 1580 cm-1 の間の同じ積分領域に正規化されました。ATR-IR 分光法では、赤外線ビームのサンプルへの侵入深さは波数に依存し、その結果、高い波数よりも低い波数でより強い吸収が生じます。これらの影響は、図 1 と 2 に示すスペクトルでは補正されていません。それらは非常に小さいため、3（補足図4）。この図の補正されたスペクトルは、Bruker OPUS ソフトウェアを使用して計算されました。
原理的には、アミド I ピーク内の成分の信頼性の高いデコンボリューションの後、タンパク質立体構造の包括的な定量化が可能です。ただし、実際にはいくつかの障害が発生します。スペクトル内のノイズは、デコンボリューション中に (偽の) ピークとして現れることがあります。さらに、水の屈曲によるピークはアミド I ピークの位置と一致しており、ここで調査した水性ゲルなど、水を大量に含むサンプルでは同様の大きさになる可能性があります。したがって、我々はアミド I ピークを完全に分解しようとはしませんでした。我々の観察は、NMR 分光法などの他の方法を裏付けるものとしてのみ考慮されるべきです。
50 mg/ml NT および His-NT2RepCT の溶液を 37℃で一晩ゲル化させました。次いで、ヒドロゲルを２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８）で１２．５ｍｇ／ｍｌの濃度まで希釈し、よく振盪し、ピペッティングしてゲルを破壊した。次に、ヒドロゲルを 20 mM Tris-HCl (pH 8) で 10 倍に希釈し、5 μl のサンプルをホルムバールでコーティングされた銅グリッドに適用し、余分なサンプルを吸い取り紙で取り除きました。サンプルを 5 μl の MilliQ 水で 2 回洗浄し、1% ギ酸ウラニルで 5 分間染色しました。余分な汚れを吸収紙で取り除き、メッシュを自然乾燥させます。イメージングは​​、100 kV で動作する FEI Tecnai 12 Spirit BioTWIN を使用して、これらのグリッド上で実行されました。画像は、Veleta 2k × 2k CCD カメラ (Olympus Soft Imaging Solutions, GmbH、ミュンスター、ドイツ) を使用して、26,500 倍および 43,000 倍の倍率で記録されました。各サンプル (n = 1) について、10 ～ 15 枚の画像が記録されました。ImageJ (https://imagej.nih.gov/) を画像解析と繊維径の測定に使用しました (n = 100、異なる繊維)。Prism 9 を使用して、対応のない t 検定 (両側) を実行しました。His-NT2RepCT および NT フィブリルの平均は、それぞれ 11.43 (SD 2.035) および 7.67 (SD 1.389) nm でした。信頼区間 (95%) は -4.246 ～ -3.275 です。自由度 = 198、p < 0.0001。
10 μM チオフラビン T (ThT) を含む液体サンプル 80 μl を、Corning 96 ウェル黒底透明底プレート (Corning Glass 3881、USA) を使用して静的条件下で 3 回測定しました (n = 3)。蛍光の違いは、440 nm 励起フィルターおよび 480 nm 発光フィルター (ドイツ、オッフェンブルクの BMG Labtech 製 FLUOStar Galaxy) を使用して記録しました。異なる濃度の ThT を用いた実験がシグナル強度を変えることなく実行されたため、ThT シグナルは飽和も消光もされませんでした。ヘイズ測定のために 360 nm での吸光度を記録します。播種実験のために、100 mg/mLのゲルを37℃で形成し、再懸濁し、5%、10%、および20%のモル比で播種に使用した。データは Prism 9 を使用して分析されました。
His-NT2RepCT および NT >100 mg/mL のストックを氷上で解凍し、0.22 μm フィルターでろ過します。濃度は、Nanodrop を使用して 280 nm での吸光度を測定することによって計算されました。透明な底を備えた 96 ウェル黒色非結合プレート (Corning) のウェルで、サンプルを 20 mM Tris-HCl pH 8 で 20 mg/ml に希釈し、5 μM ThT (最終濃度) と混合しました。総サンプル濃度50μlの容量。サンプルは、ThT イメージング用の透過光チャネルと FITC 励起および発光フィルター セットを備えた CellObserver (Zeiss) 顕微鏡で 37 °C で 10 分ごとにイメージングされました。撮像には20x/0.4レンズを使用します。画像解析には Zen Blue (Zeiss) と ImageJ (https://imagej.nih.gov/) を使用しました。20 mM Tris pH 8 および 5 μM ThT を含む 50 mg/mL の濃度の NT および His-NT2RepCT 溶液からもゲルを調製し、37℃で 90 分間インキュベートしました。ゲル片を、非結合黒色９６ウェル透明底プレート内の２０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ８、および５μＭ ＴｈＴを含む新しいウェルに移した。20x/0.4 の倍率で緑色蛍光画像と明視野画像を取得します。画像解析にはImageJを使用しました。
溶液ＮＭＲスペクトルは、ＱＣＩ四重極共鳴パルス勾配磁場クライオプローブ（ＨＦＣＮ）を備えた６００ＭＨｚのＢｒｕｋｅｒ Ａｖａｎｃｅ Ｎｅｏ分光計で３１０Ｋで得た。20 mM Tris-HCl (pH 8)、0.02% (w/v) NaN3、5% DO (v/v) に溶解した、13C、15N で標識された 10 mg/mL の均一なタンパク質を含む NMR サンプル (n = 1) 。pH 6.7 での NT2RepCT の化学シフトを使用して、15N-HSQC の 2D スペクトルのピーク 23 を割り当てました。
13C、15N標識ヒドロゲルのマジックアングルスピニング固体NMR(MAS)スペクトルは、3.2mmの13C/15N{1H}電子なしプローブを備えたBruker Avance III HD分光計で800MHzで記録した。サンプル温度は、277 K の可変温度ガス流を使用して制御されました。二次元双極子回転共鳴 (DARR)76 スペクトルと無線周波数リコネクション (RFDR)77 スペクトルは、それぞれ 12.5 kHz と 20 kHz の MAS 周波数で取得されました。1H から 13C までの交差分極 (CP) は、1H で 60.0 から 48.0 kHz、13C で 61.3/71.6 kHz (12.5/20 kHz MAS) の直線ランプと接触時間 0.5 ～ 1 ms を使用して実行されました。データ収集中に、73.5 kHz での Spinal6478 デカップリングが使用されました。取得時間は 10 ミリ秒、サイクル遅延は 2.5 秒でした。RFDR スペクトルで観察された単結合 Cα/Cβ 相関は、DARR スペクトルの特徴的な残基タイプの化学シフトと多重結合相関に基づいて割り当てられました。
Zipper79 データベース (https://services.mbi.ucla.edu/zipperdb/) を使用して、NT、NTFlSp、および NTMiSp のフラッター傾向とロゼッタ エネルギーを評価しました。Zipper データベースは、いくつかの自由エネルギー関数を組み合わせてタンパク質構造をモデル化し、分析する Rosetta Energy80 を計算します。-23 kcal/mol 以下のエネルギー レベルは、フィブリル化の傾向が高いことを示します。エネルギーが低いということは、ジッパー構造における 2 つの β ストランドの安定性が高いことを意味します。さらに、Waltz アルゴリズムを使用して、NT、NTFlSp、および NTMiSp のアミロイド生成領域を予測しました。81. (https://waltz.switchlab.org/)。
NT タンパク質溶液を、pH 5.5 および 6.0 の 2-(N-モルホリノ) エタンスルホン酸 (MES) 緩衝液と混合して、pH をそれぞれ pH 6 および 7 に下げました。最終タンパク質濃度は１００ｍｇ／ｍｌであった。
測定は、光路0.1cmの300μLキュベットを使用してJ-1500 CD分光計(JASCO、USA)で実施した。タンパク質を20 mM リン酸緩衝液（pH 8）で10 μM（n = 1）に希釈しました。塩の存在下でのタンパク質の安定性を分析するために、タンパク質を、それぞれ 154 mM NaF または NaCl を含む 20 mM リン酸緩衝液 (pH 8) 中で同じ濃度 (n = 1) で分析しました。温度スキャンは、1℃/分の加熱速度で25℃から95℃まで222nmで記録されました。ネイティブに折りたたまれたタンパク質の割合は、式 (KDmeasure – KDfinal)/(KDstart – KDfinal) を使用して計算されました。さらに、25°C および 95°C に加熱した後、各サンプルについて 260 nm から 190 nm までの 5 つのスペクトルが記録されました。5 つのスペクトルを平均し、平滑化し、モル楕円率に変換しました。データは Prism 9 を使用して分析されました。
His-NT-GFP (300 mg/mL、80 μL) の蛍光強度を、黒色透明底の 96 ウェル Corning プレート (Corning Glass 3881、USA) で静的条件下で 3 回測定しました (n = 3)。励起波長 395 nm の蛍光ベースのプレートリーダーでサンプルを測定し、ゲル化前とゲル化 2 時間後に 37°C で 509 nm での発光を記録します。データは Prism 9 で分析されました。
プリンヌクレオシドホスホリラーゼ活性アッセイキット（蛍光分析法、Sigma Aldrich）を製造業者の指示に従って使用した。His-NT-PNP を含むゲルおよび溶液の活性を測定するには、ゲルがセットの検出間隔を超えるシグナルを発するため、10 ng の His-NT-PNP を 100 mg/mL NT と総量 2 μL まで混合します。His-NT-PNPを含まないゲルおよび溶液の対照が含まれていました。測定は 2 回実行されました (n = 2)。活性を測定した後、反応混合物を取り出し、ゲルの写真を撮って、測定中にゲルが無傷であることを確認した。データは Prism 9 を使用して分析されました。
研究デザインの詳細については、この記事にリンクされている Nature 研究の要約を参照してください。
図 1 と 2 は初期データを示しています。1c、2a〜c、3a、b、e〜g、4、5b、d、f、および6、補足図。3、補足図。5a、d、補足図。6および補足図。8. データ この研究のデータは Zenodo データベース https://doi.org/10.5281/zenodo.6683653 にホストされています。この研究で得られた NMR データは、エントリー ID bmrbig36 で BMRBig リポジトリに投稿されました。GFP と PNP の構造は PDB (GFP 2B3Q、PNP 4RJ2) から取得しました。
ライジング、A. とヨハンソン、J. 人工クモの糸を紡ぐ。ナショナルケミカル。生物学。11、309–315 (2015)。
バブ、ＰＬら。ジョロウグモのゲノムは、クモの糸遺伝子の多様性とその複雑な発現を明らかにしています。ナショナルジュネット。49、895–903 (2017)。