347 12.7*1.24mm ステンレス鋼コイルチューブ、α-シヌクレインとタウの同時静電凝縮・共凝集の分子機構

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347ステンレス鋼管仕様

347 12.7*1.24mm ステンレス鋼コイルチューブ

外径: 6.00 mm OD ～ 914.4 mm OD、最大 24 インチ NB のサイズが在庫あり、OD サイズのスチールチューブが在庫あり

SS 347 パイプ厚さ範囲: 0.3mm – 50 mm、SCH 5、SCH10、SCH 40、SCH 80、SCH 80S、SCH 160、SCH XXS、SCH XS
WT：SCH5S、SCH10S、SCH40S、SCH80S、SCH160Sなど（0.5〜12mm）または必要に応じて調整される非レギュラーサイズ

タイプ: SS 347 シームレス パイプ |SS 347 ERW パイプ |SS 347 溶接パイプ |SS 347 加工パイプ |SS 347 CDW チューブ、LSAW パイプ / シーム溶接 / 引き抜き

形状: SS 347 丸パイプ/チューブ、SS 347 角パイプ/チューブ、SS 347 長方形パイプ/チューブ、SS 347 コイルチューブ、SS 347 「U」字型、SS 347 パンケーキコイル、SS 347 油圧チューブ

長さ: シングルランダム、ダブルランダム & 必要な長さ エンド: プレーンエンド、ベベルエンド、トレッドエンド

端部保護: プラスチック キャップ |外側仕上げ: 2B、No.4、No.1、No.8 ステンレス鋼管用鏡面仕上げ、顧客の要件に応じた仕上げ

納品条件: 焼鈍および酸洗、研磨、光輝焼鈍、冷間引抜

検査、テストレポート: 工場テスト証明書、EN 10204 3.1、化学レポート、機械レポート、PMI テストレポート、目視検査レポート、第三者検査レポート、NABL 承認ラボレポート、破壊テストレポート、非破壊テストレポート

梱包: 木箱、ビニール袋、スチールストリップに梱包、または顧客の要求に応じて梱包

特殊：上記以外のサイズ・仕様も特注にて製作可能です

SS 347 パイプ サイズ範囲: 1/2 インチ NB、OD ～ 24 インチ

ASTM A312 347: 高温および一般腐食用途向けのシームレスでストレートシーム溶接されたオーステナイトパ​​イプ。溶接中にフィラーメタルは許可されません。

ASTM A358 347: 腐食性および/または高温使用用の電気融着溶接されたオーステナイト系パイプ。通常、この仕様に従って製造されるのは 8 インチまでのパイプのみです。溶接中に溶加材の追加が許可されます。

ASTM A790 347: 応力腐食割れに対する耐性に特に重点を置いた、一般的な腐食用途向けのシームレスおよびストレートシーム溶接フェライト/オーステナイト (二相) パイプ。

ASTM A409 347: ストレートシームまたはスパイラルシーム電気融着溶接された大口径オーステナイト系ライトウォールパイプ、サイズ 14 インチ～30 インチ、腐食性および/または高耐食性の壁 Sch5S および Sch 10S 付き

ASTM A376 347: 高温用途向けのシームレスオーステナイトパ​​イプ。

ASTM A813 347: 高温および一般腐食用途向けのシングルシーム、シングルまたはダブル溶接オーステナイト パイプ。

ASTM A814 347: 高温および一般腐食用途向けの冷間加工溶接オーステナイトパ​​イプ。

347H ステンレス鋼管の化学成分

ステンレス鋼347Hパイプの機械的性質

ステンレス鋼347Hパイプの物性

347Hステンレス鋼管の相当グレード

アミロイド アルファ シヌクレイン (αS) の凝集は、パーキンソン病およびその他のシヌクレイノパチーの特徴です。最近、アルツハイマー病に一般的に関連するタウタンパク質がαS病態と関連しており、αSに富む封入体に共局在することが判明したが、2つのタンパク質の共凝集の分子機構は依然として不明である。我々はここで、αS相がタウなどの正に荷電したポリペプチドとの静電複合体縮合を介して液体凝縮物に分離することを報告する。ポリカチオンに対するαSの親和性および凝固ネットワークの原子価減少速度に応じて、血餅は急速なゲル化または合体を起こし、その後ゆっくりとアミロイド凝集が起こります。一連の高度な生物物理学技術を組み合わせることで、液液 αS/タウ相分離の特徴を明らかにし、液体タンパク質凝縮物中で両方のタンパク質を含む不均一な凝集体の形成につながる重要な要因を特定することができました。
膜コンパートメントに加えて、細胞内の空間分離は、液液相分離 (LLPS) として知られるプロセスを介して、生体分子凝縮物または液滴と呼ばれるタンパク質が豊富な液体状の緻密体の形成によっても達成できます。これらの液滴は、通常はタンパク質間、またはタンパク質と RNA の間の多価の時間的相互作用によって形成され、ほぼすべての生命システムでさまざまな機能を果たします。多数の LLP 対応タンパク質は、性質上および生体分子凝縮物の形成において高度に無秩序な、複雑性の低い配列を示します 3、4、5。多くの実験研究により、これらの液体状の凝縮物を構成するタンパク質の柔軟で、多くの場合無秩序で、多価の性質があることが明らかになりましたが、これらの凝縮物の成長と成熟を制御してより固体に近いものにする特定の分子決定因子についてはほとんどわかっていません。州。。
新しいデータは、異常なタンパク質駆動型のLLPSと液滴の固体構造への変換が、変性疾患の特徴であることが多い不溶性の有毒凝集体の形成につながる関連する細胞経路である可能性があるという仮説を裏付けるものである。多くの LLPS 関連内因性無秩序タンパク質 (IDP) は、多くの場合高度に帯電していて柔軟性があり、アミロイド凝集のプロセスによる神経変性と長い間関連付けられてきました。特に、FUS7 や TDP-438 などの生体分子 IDP 縮合物、または hnRNPA19 などの大きな低複雑性ドメインを持つタンパク質は、流動化と呼ばれるプロセスを通じてゲル状、さらには固体の形態に変化することが示されています。化合物。固相転移（LSPT）への変化は、時間の関数として、または特定の翻訳後修飾または病理学的に重要な変異に応答して起こります1、7。
in vivo で LLPS に関連するもう 1 つの IDP は、微小管関連無秩序タンパク質であるタウであり、そのアミロイド凝集はアルツハイマー病に関係していると考えられています 10 が、最近ではパーキンソン病 (PD) や他のシナプス核タンパク異常症にも関係しているとされています 11、12、13。タウは、好ましい静電相互作用により溶液/細胞質から自発的に解離することが示されており 14 、その結果、静電コアセルベートとして知られるタウが豊富な液滴が形成されます。このタイプの非特異的相互作用が、自然界の多くの生体分子凝縮物の背後にある原動力であることも観察されています 15。タウタンパク質の場合、静電凝集は、タンパク質の逆に帯電した領域が切断プロセスを引き起こす単純な凝集によって、または RNA などの負に帯電したポリマーとの相互作用を介した複雑な凝集によって形成されます。
最近、α-シヌクレイン (αS) は、シヌクレイン障害として総称される PD やその他の神経変性疾患に関係するアミロイド IDP であり 17,18 、細胞モデルや動物モデルで 19,20 、流体様の挙動を示すタンパク質凝縮物中に集中していることが実証されました。in vitro 研究では、αS は主に疎水性相互作用による単純な凝集によって LLPS を起こすことが示されていますが、このプロセスには非常に高いタンパク質濃度と異常に長いインキュベーション時間が必要です 19,21。生体内で観察されるαS含有凝縮物がこのLLPSプロセスによって形成されるのか、それとも他のLLPSプロセスによって形成されるのかは、依然として重要な未解決の問題である。同様に、αS アミロイド凝集は PD およびその他のシヌクレイノパチーのニューロンで観察されていますが、αS が細胞内アミロイド凝集を起こす正確なメカニズムは不明のままであり、このタンパク質の過剰発現自体がこのプロセスを引き起こすとは思われないためです。追加の細胞損傷が必要となることが多く、細胞内αS アミロイド集合体の再核形成には特定の細胞の位置または微小環境が必要であることが示唆されています。特に凝集しやすい細胞環境の 1 つは、タンパク質凝縮物の内部である可能性があります 23。
興味深いことに、αS とタウは、パーキンソン病やその他のシヌクレイノパチーを患うヒトの特徴的な疾患封入体に共局在することが判明しており 24,25、実験では 2 つのタンパク質間の相乗的な病理学的関係が報告されており 26,27 、これは凝集αS とタウの間の潜在的な関係を示唆しています。神経変性疾患におけるタウ。病気。αS とタウは、インビトロおよびインビボで相互作用して互いの凝集を促進することがわかっており 28,29 、これら 2 つのタンパク質から構成される不均一な凝集体がシヌクレイノパチー患者の脳で観察されています 30 。しかし、αSとタウの相互作用の分子基盤やその共凝集の機構についてはほとんどわかっていない。αS は、αS の高度に負に帯電した C 末端領域と、やはり正に帯電した残基が豊富なタウの中央のプロリンに富む領域との間の静電引力を介してタウと相互作用すると報告されています。
この研究では、ポリ-L-リジン（pLK）などの他の正に荷電したポリペプチドとの相互作用とは対照的に、αSはタウタンパク質の存在下で静電複合体凝縮を介して実際に液滴に解離できることを示し、このプロセスでは 。αS は液滴ネットワークの足場分子として機能します。我々は、静電αSコアセルベートの成熟プロセスにおける顕著な違いを特定しました。これは、コアセルベートネットワークに関与するタンパク質の相互作用の価数と強度の違いに関連しています。興味深いことに、我々は長寿命の液体コアセルベートにおけるαSおよびタウアミロイドタンパク質の共凝集を観察し、そのようなコアセルベートにおけるこれら2つのタンパク質の共凝集を引き起こすいくつかの重要な因子を特定した。ここでは、疾患特異的な封入体における 2 つのタンパク質の共局在化の根底にある考えられる分子機構であるこのプロセスを詳細に説明します。
αSは中性pHで高度にアニオン性のC末端尾部を持ち（図1a）、我々はαSがポリカチオン性無秩序ポリペプチド分子との静電複合体の縮合を通じてLLPSを起こす可能性があると仮説を立てた。中性 pH 32 では正に帯電し無秩序なポリマーの性質を示すため、出発モデル分子として 100 残基のポリ-L-リジン (pLK) を使用しました。 まず、溶液 NMR 分光法により、pLK が αS の Ct ドメインと相互作用することを確認しました。 (図 1b) 増加する αS:pLK モル比の存在下で 13C/15N 標識αS を使用。pLK と αS の Ct ドメインとの相互作用は、化学シフトの摂動とタンパク質のこの領域のピーク強度の減少として現れます。興味深いことに、αS と pLK を αS 濃度約 100% で混合したとき、ポリエチレングリコール (5 ～ 15% PEG-8) の存在下で 5 ～ 25 μM (通常の LLPS 緩衝液: 10 mM HEPES pH 7.4、100 mM NaCl、15% PEG-8) で、広範なタンパク質形成領域を即座に実行しました。 。液滴は、蛍光（WF）顕微鏡および明視野（BF）顕微鏡を使用して観察されました（図1c）。濃縮された αS を含む 1 ～ 5 µm の液滴 (1 µM AlexaFluor488 標識 αS、AF488-αS を添加) の静電特性は、10% 1,6-ヘキサンジオール (1,6-HD) に対する耐性とその感受性から導き出すことができます。 NaCl 濃度の増加 (図 1c)。αS/pLK静電複合体のコアセルベートの流体のような性質は、ミリ秒以内に融合する能力によって実証されています（図1d）。濁度測定を使用して、これらの条件下での液滴の形成を定量化し、その安定性に関連する主な相互作用の静電的性質を確認し（図1e）、LLPSプロセスに対するさまざまなポリマー比の影響を評価しました（図1f）。液滴形成は広範囲のポリマー比にわたって観察されますが、pLK が αS を超える場合、このプロセスは非常に有利です。LLP は、化学的に異なる置換剤デキストラン 70 (70 kDa) を使用したり、ガラス スライド ドロップ、さまざまな材料のマイクロプレート ウェル、エッペンドルフまたは石英キャピラリーなどのさまざまなサンプル形式を使用したりすることでも観察されています。
a この研究で使用した WT-αS および ΔCt-αS バリアントのさまざまなタンパク質領域の概略図。両親媒性 N 末端ドメイン、疎水性アミロイド形成 (NAC) 領域、および負に荷電した C 末端ドメインは、それぞれ青、オレンジ、赤で示されています。WT-αS の Net Charge Per Residual (NCPR) マップを示します。b 高分子凝集塊の非存在下での αS/pLK 相互作用の NMR 分析。pLK 濃度が増加するにつれて (αS:pLK モル比 1:0.5、1:1.5、および 1:10 は、それぞれ薄緑色、緑色、および濃い緑色で示されます)。c LLPS バッファー (上) または 500 mM NaCl を添加したもの (左下) または 10 % 1,6-ヘキサンジオール (1,6-HD; 右下)。スケールバー = 20 μm。d 25μMの濃度でのαS/pLK（モル比1：10）のBF液滴融合の代表的な顕微鏡画像。矢印は、200 ミリ秒以内に個々のドロップ (赤と黄色の矢印) が新しいドロップ (オレンジ色の矢印) にマージされることを示します。スケールバー = 20 μm。e 25 μM αS での 500 mM NaCl または 10% 1,6-HD の添加前後の LLPS バッファー中の光散乱 (350 nm) αS/pLK 凝集 (N = 3 サンプルの反復、平均値と標準偏差も表示)。f αS:pLK モル比の増加に伴う 25 μM αS での αS / pLK 凝集体の BF 画像 (上) および光散乱分析 (350 nm、下) (N = 3 サンプルの反復、平均値と標準偏差も示します)。スケールバー = 10 μm。1 つの画像上のスケール バーは、1 つのパネル内のすべての画像のスケールを示します。生データは生データ ファイルの形式で提供されます。
αS/pLK静電複合体縮合の観察と、tau31との直接相互作用を介したタウ/RNA縮合物のクライアント分子としてのαSの以前の観察に基づいて、αSとタウはRNAの非存在下で溶媒と共分離できるという仮説を立てました。結露。αSは、αS/タウコアセルベートの足場タンパク質です（図2eのタウ電荷分布を参照）。WF 顕微鏡で観察したように、10 μM αS と 10 μM Tau441 (それぞれ 1 μM AF488-αS と 1 μM Atto647N-Tau を含む) を LLPS 緩衝液中で混合すると、両方のタンパク質を含むタンパク質凝集体が容易に形成されることが観察されました。(図2a)。液滴中の2つのタンパク質の共局在は、共焦点（CF）顕微鏡法によって確認されました（補足図1a）。デキストラン-70 を凝集剤として使用した場合にも、同様の挙動が観察されました (補足図 1c)。FITC標識PEGまたはデキストランのいずれかを使用すると、両方のクラウディング剤がサンプル全体に均一に分布し、分離も会合も示されていないことがわかりました（補足図1d）。むしろ、他の LLP システムで見られるように、PEG は優先的に安定なクラウディング剤であるため、この系では高分子クラウディング効果によって相分離が促進されることを示唆しています 33,34。これらのタンパク質が豊富な液滴は、NaCl (1 M) には感受性がありましたが、1,6-HD (10% v/v) には感受性がなく、静電特性が確認されました (補足図 2a、b)。それらの流体の挙動は、BF顕微鏡を使用してミリ秒の液滴の融合イベントを観察することによって確認されました（図2b）。
a LLPS緩衝液中のαS / Tau441コアセルベートの共焦点（CF）顕微鏡画像（各タンパク質10μM、AF488標識αSおよびAtto647N標識Tau441 0.5μM）。b αS/Tau441 液滴融合イベントの代表的な微分干渉コントラスト (DIC) 画像 (各タンパク質について 10 μM)。c 50μM αSの非存在下（左）または存在下（右）におけるTau441 LLPS（0〜15μM）の光散乱（350nm）に基づく相図。暖色系は散乱が多いことを示します。d αS濃度の増加に伴うαS / Tau441 LLPSサンプルの光散乱（5μMのTau441、示されているように、N = 2〜3サンプルの繰り返し）。e この研究で使用したいくつかのタウタンパク質変異体とタンパク質のさまざまな領域の概略図：負に荷電したN末端ドメイン（赤）、プロリンに富んだ領域（青）、微小管結合ドメイン（MTBD、オレンジ色で強調表示）、およびアミロイド形成ペアスパイラル。MTBD 内に位置するフィラメント領域 (PHF) (灰色)。Tau441 の残留物あたりの正味電荷 (NCPR) マップが示されています。f 1 μM AF488 標識 αS および Atto647N 標識 ΔNt- を使用、ΔNt-Tau (上、タンパク質あたり 10 μM) または K18 (下、タンパク質あたり 50 μM) の存在下で 1 μM AF488 標識 αS または ΔCt-αS を使用) ) ) LLPS または K18 バッファー中で濃縮された WF の顕微鏡写真。1 つの画像内のスケール バーは、1 つのパネル内のすべての画像のスケールを表します (パネル a、b、f では 20 μm)。パネル c および d の生データは、生データ ファイルとして提供されます。
このLLPSプロセスにおけるαSの役割をテストするために、最初にNaCl濃度を増加させて比濁法により液滴安定性に対するαSの影響を調査しました（図2c）。αS を含むサンプルの塩濃度が高いほど、光散乱値 (350 nm) が高くなります。これは、この LLPS システムにおける αS の安定化の役割を示しています。同様の効果は、αS 濃度 (したがって、αS:Tau441 比) を約 100% まで増加させることによって観察できます。タウ濃度（5μM）と比較して10倍増加（図2d）。αSがコアセルベートの足場タンパク質であることを実証するために、ΔNt-Tauと呼ばれる負に帯電したN末端領域（残基1〜150、図2eを参照）を欠くLLPS破壊タウ変異体の挙動を調査することにしました。WF顕微鏡法と比濁法により、以前に報告されているように、ΔNt-Tau自体がLLPSを受けないことが確認されました14（図2fおよび補足図2d）。ただし、この短縮型タウバリアントの分散溶液にαSを添加すると、LLPSプロセスは完全に完了しました。同様の条件およびタンパク質濃度の下で、タウおよびαSのフルサイズ溶液の液滴密度に近い液滴密度で復元されました。このプロセスは、高分子の密集度が低い条件下でも観察できます（補足図2c）。LLPSプロセスにおけるC末端αS領域の役割（その全長ではない）は、（ΔCt- αS)タンパク質（図2fおよび補足図2d）。αSとΔNt-Tauの共局在は、共焦点蛍光顕微鏡によって確認されました（補足図1b）。
Tau441 と αS の間の LLPS 機構をさらにテストするために、追加のタウ変異体、つまり微小管結合ドメイン (MTBD) 内の対らせんフィラメント コア (PHF) フラグメントを使用しました。これには、一般的に知られている 4 つの特徴的な反復ドメインが含まれています。 K18フラグメントとして（図2eを参照）。最近、αS が微小管結合ドメインに先行する配列のプロリンに富むドメインに位置するタウタンパク質に優先的に結合することが報告されています。ただし、PHF領域には正に荷電した残基（図2eを参照）、特にリジン（15％残基）も豊富であるため、この領域もαS / Tau複合体の縮合に寄与しているかどうかをテストするようになりました。試験した条件（15％PEGまたは20％デキストランを含むLLPS緩衝液）下では、K18単独では最大100μMの濃度でLLPSを誘発できないことが観察されました（図2f）。ただし、50μM αSを50μM K18に添加すると、K18とαSを含むタンパク質液滴の急速な形成が比濁法（補足図2d）およびWF顕微鏡法（図2f）によって観察されました。予想通り、ΔCt-αSはK18のLLPS挙動を回復できませんでした（図2f）。他の条件が等しい場合、αS/K18 凝集では、αS/ΔNt-Tau または αS/Tau441 と比較して、LLPS を誘導するためにわずかに高いタンパク質濃度が必要であることに注目します。これは、以前に記載されているように、微小管結合ドメインと比較して、αS C末端領域とプロリンに富むタウドメインとのより強い相互作用と一致している 31 。
ΔNt-Tau は αS の非存在下では LLPS を実行できないことを考慮して、完全長タウ (アイソタイプ、Tau441/Tau441) を含む LLPS システムでの単純性を考慮して、αS/タウ LLPS を特徴付けるモデルとしてこのタウ バリアントを選択しました。複雑な（異型、αS/Tau441）凝集プロセスを伴う。αS/Tau系とαS/ΔNt-Tau系におけるαS凝集度（凝縮相タンパク質fαS,cの一部として）を遠心分離および分散相SDS-PAGE分析により比較しました（2eを参照）。非常に類似した値が見つかりました。すべてのタンパク質を同じ濃度で。特に、αS/TauおよびαS/ΔNt-TauについてそれぞれfαS,c 84±2%および79±7%が得られ、αSとタウ間のヘテロタイプ相互作用がタウ分子間の相互作用よりも優れていることが示唆されました。間。
さまざまなポリカチオンとの相互作用およびαS 反応速度論に対する縮合プロセスの影響は、光退色後の蛍光回復 (FRAP) 法によって最初に研究されました。αS/Tau441、αS/ΔNt-TauおよびαS/pLKコアセルベート（2μM αS AF488-αSおよび100μM Tau441またはΔNt-Tauまたは1 mM pLKを補充した100μM αS）をテストしました。データは、サンプル成分を混合した後、最初の 30 分以内に取得されました。代表的な FRAP 画像（図 3a、αS / Tau441 凝縮）およびそれらの対応する時間経過曲線（図 3b、補足図 3）から、αS 動態は Tau441 コアセルベートの動態と非常に類似していることがわかります。ΔNt-Tau は、pLK を使用するとはるかに高速になります。FRAP (Kang et al. 35 によって記載) に従ってコアセルベート内部の αS について計算された拡散係数は、αS/Tau441 および αS/ΔNt- の場合は D = 0.013 ± 0.009 μm2/s および D = 0.026 ± 0.008 μm2/s です。 αS/システム。pLK、Tau、D = 0.18 ± 0.04 µm2/s それぞれ (図 3c)。ただし、分散相の拡散係数 αS は、同じ条件 (LLPS バッファー) でポリカチオンが存在しない場合の蛍光相関分光法 (FCS、補足図 3 を参照) によって測定されたように、すべての凝縮相よりも数桁高くなります。 (D = 8 ± 4 μm2/秒)。したがって、すべてのコアセルベートは、タウ相とは対照的に、形成後の最初の30分間は液体のような特性を保持しますが、コアセルベートでは、顕著な分子密集効果により、分散相のタンパク質と比較して、αS翻訳の動態が大幅に低下します。pLK凝縮物の反応速度が速くなります。
a-c 静電コアセルベート中のαSダイナミクス（2％AF488標識αS）のFRAP分析。3 連の αS/Tau441 FRAP アッセイの代表的な画像を (a) に示します。赤い丸は脱色領域を示します。スケールバーは5μmです。b 100 μM αSと等モル濃度のTau441（赤）またはΔNt-Tau（青）またはpLK（緑）を使用した3つの実験からの5〜6（N）の異なる液滴の平均FRAP曲線および（c）計算された拡散係数（D） LLPSの10倍の濃度です。FRAP 曲線の標準偏差は影付きで表示されます。比較のために、分散相の拡散係数 αS は、蛍光相関分光法 (FCS) を使用して 3 回測定されました (詳細については、補足図 3 と方法を参照)。d ポリカチオンなし（黒）、または100μM Tau441（赤）またはΔNt-Tau（青）または1 mM pLK（緑）の存在下でのLLPSバッファー中の100μM TEMPOL-122-αSの連続XバンドEPRスペクトル。挿入図は、最も劇的な変化が起こる強い磁力線の拡大図を示しています。e LLPS非存在下（PEGなし）での50μM TEMPOL-122-αSと様々なポリカチオンとの結合曲線。正規化 EPR スペクトルのバンド II (IIII/III) と比較してバンド III の振幅が減少していることは、Tau441 (赤色)、ΔNt-Tau (青色)、および pLK (緑色) のモル比を増加させることが示されています。色付きの線は、各曲線上に n 個の同一の独立した結合部位を持つ大まかな結合モデルを使用したデータへの適合を示します。生データは生データ ファイルの形式で提供されます。
補足として、有向スピン標識 (SDSL) と連続電子常磁性共鳴 (CW-EPR) を使用して、さまざまなコアセルベートにおける αS のダイナミクスを調査しました。この方法は、現実的な残差解像度で IDP の柔軟性とダイナミクスを報告するのに非常に役立つことが証明されています 36、37、38。この目的を達成するために、我々は単一の Cys 変異体でシステイン残基を構築し、4-ヒドロキシ-2,2,6,6-テトラメチルピペリジン-N-オキシル (TEMPOL) スピン プローブを使用しました。マレイミド誘導体はそれらを標識します。より具体的には、TEMPOL プローブを 122 または 24 αS の位置に挿入しました (TEMPOL-122-αS および TEMPOL-24-αS)。最初のケースでは、ポリカチオンとの相互作用に関与するタンパク質の C 末端領域をターゲットとします。代わりに、位置 24 からは、凝縮液中のタンパク質の全体的な動態に関する情報が得られます。どちらの場合も、分散相のタンパク質について得られた EPR シグナルは、高速移動状態のニトロキシドラジカルに対応していました。タウまたは pLK (100 μM TEMPOL-αS、Tau441 または ΔNt-Tau を 1:1 の比率で、または pLK を 1:10 の比率で) の存在下で相分離した後、相対ピーク強度の増加が観察されました。 αS の EPR スペクトル。損失線は広がり、希釈相のタンパク質と比較して液滴のαS再配向動態が低下していることを示しています（図3d、補足図4a）。これらの変化は位置122でより顕著です。位置24ではpLKの存在はプローブの動態に影響を与えませんでしたが、位置122ではスペクトル線の形状が大きく変化しました（補足図4a）。スピン標識されたIDP38、39のダイナミクスを説明するために一般的に使用される等方性モデル（補足図5a）を使用して、2つのαS /ポリカチオンシステムの位置122のスペクトルをモデル化しようとしましたが、実験スペクトルを再構成できませんでした。。24のスピンコントラストの位置のスペクトルシミュレーション（補足図5a）。これは、ポリカチオンの存在下では、αS の C 末端領域のスピン配置の空間に優先的な位置が存在することを示唆しています。実験的 EPR 条件下での凝縮相の αS の割合を考慮する場合 (αS/Tau441、αS/ΔNt-Tau、および αS/pLK でそれぞれ 84 ± 2%、79 ± 7%、および 47 ± 4%) - 補足を参照データ分析 c) の図 2e では、EPR 法によって検出された広がりは主に、αS の C 末端領域と凝縮相内のさまざまなポリカチオンとの相互作用を反映していることがわかります (TEMPOL-122- を使用した場合の主な変化) αS)、タンパク質の凝縮ではありません。プローブ内で微粘度の増加が観察されます。予想通り、1 M NaClを混合物に添加すると、LLPS以外の条件下でのタンパク質のEPRスペクトルが完全に回復しました（補足図4b）。全体として、我々のデータは、CW-EPRによって検出された変化が主に、αSのC末端領域と凝縮相内のさまざまなポリカチオンとの相互作用を反映していることを示唆しており、この相互作用はタウよりもpLKでより強いようです。
コアセルベート内のタンパク質に関するより多くの構造情報を得るために、溶液中での NMR を使用して LLPS システムを研究することにしました。しかし、分散相に残っている αS 画分しか検出できませんでした。これは、NMR 分析でコアセルベート内のタンパク質の動態が低下し、溶液の底部に緻密な相が存在したためと考えられます。NMRを使用してLLPSサンプルの分散相に残っているタンパク質の構造と動態を分析したところ（補足図5c、d）、タンパク質はpLKとΔNt-Tauの両方の存在下でほぼ同じように動作することに気づきました。これらは、二次化学シフトとR1ρ緩和に関する実験によって明らかになった、タンパク質骨格の二次構造とダイナミクスにありました。NMR データは、αS の C 末端は、ポリカチオンとの相互作用により、タンパク質配列の他の部分と同様に、その無秩序な性質を維持しながら、立体構造の柔軟性を大幅に失っていることを示しています。
TEMPOL-122-αS 凝縮相で観察される CW-EPR シグナルの広がりは、タンパク質とポリカチオンの相互作用を反映しているため、LLPS の非存在下（αS の蓄積がない）でさまざまなポリカチオンに対する αS の結合親和性を評価するために EPR 滴定を実行しました。緩衝液LLPS）、相互作用は希薄相と濃縮相で同じであることを示唆しています（これは私たちのデータ、補足図4aおよび補足図6によって確認されています）。目標は、すべてのコアセルベートが、共通の流体のような特性にもかかわらず、分子レベルで根本的な異なる挙動を示すかどうかを確認することでした。予想通り、EPRスペクトルはポリカチオン濃度の増加とともに広がり、ほぼ飽和に達するすべての相互作用パートナーの分子相互作用による分子の柔軟性の低下を反映しています（図3e、補足図6）。pLKは、ΔNt-TauおよびTau441と比較して、より低いモル比(ポリカチオン:αS)でこの飽和を達成した。実際、n 個の同一かつ独立した結合部位を仮定した近似結合モデルとデータを比較すると、pLK (約 5 μM) の見かけの解離定数は、Tau441 または ΔNt-Tau (約 50 μM) の解離定数よりも 1 桁低いことが示されました。 ）。μM）。これは大まかな推定ではありますが、αS は連続した正電荷領域を持つ単純なポリカチオンに対して高い親和性を持っていることを示唆しています。αS とさまざまなポリカチオンの間の親和性の違いを考慮すると、それらの液体特性は時間の経過とともに異なる変化を示し、したがって異なる LSPT プロセスの影響を受ける可能性があると仮説を立てました。
タンパク質コアセルベート内の非常に密集した環境とタンパク質のアミロイド性質を考慮して、考えられるLSPTプロセスを検出するために、コアセルベートの挙動を経時的に観察しました。BFおよびCF顕微鏡法（図4）を使用して、αS / Tau441が溶液中でかなりの程度コアセルベート化し、予想どおり、完全な液滴としてウェル/スライドの底に接触して表面を濡らす大きな液滴を形成することが観察されました（補足図） .7d);私たちは、これらの底部に形成された構造を「タンパク質ラフト」と呼びます。これらの構造は融合する能力を保持しているため流体のままであり（補足図7b）、LLPSが誘発された後も数時間見ることができました（図4および補足図7c）。不均衡な電荷を持ち、したがって高い静電表面電位を持つ静電コアセルベートで予想されるように、濡れプロセスは疎水性材料よりも親水性材料の表面で優先されることが観察されました（補足図7a）。特に、αS/ΔNt-Tauの合体とラフティングは大幅に減少し、αS/pLK凝縮体は大幅に減少しました（図4）。短いインキュベーション時間の間、αS/pLK 液滴は合体して親水性表面を濡らすことができましたが、このプロセスはすぐに停止し、5 時間のインキュベーション後では限られた合体現象のみが観察され、濡れは観察されませんでした。– ジェルからドリップへの移行。
100 μM Tau441 存在下、LLPS 緩衝液中に 100 μM αS (1% 蛍光標識) を含むコアセルベートサンプルの代表的な BF (グレースケール パネル) および CF (右パネル、緑色で AF488 標識 αS) の顕微鏡画像 (上) 蛍光) - 異なるインキュベーション時間および焦点高さ (z、プレートウェルの底からの距離) でのタウ (中央) または 1 mM pLK (下)。実験は互いに独立して 4 ～ 6 回繰り返され、同じ結果が得られました。αS/Tau441 コアセルベートは 24 時間後に湿潤し、画像より大きなラフトを形成します。すべての画像のスケール バーは 20 μm です。
次に、αS/Tau441 LLPSで形成された大きな液体状タンパク質プールが、研究されたタンパク質のいずれかのアミロイド凝集を引き起こすかどうかを調べました。上記と同じ条件下で、ただし1μMのAF488標識αSおよびAtto647N標識Tau441を使用して、WF顕微鏡でαS / Tau441液滴の成熟を経時的に追跡しました（図5a）。予想通り、成熟プロセス全体を通じて完全なタンパク質の局在が観察されました。興味深いことに、約から。5時間後、ラフト内でより強力な非円形構造が観察され、これを「ポイント」と呼び、その一部はαSと共局在し、一部はTau441が豊富でした（図5a、白い矢印）。これらのスポットは、αS/ΔNt-Tau よりもαS/ΔNt-Tau の方がラフト内で常に観察されています。融合/湿潤ができない pLK および Tau システムの液滴には明確なスポットはありませんでした。αS および Tau441 を含むこれらの染色がアミロイド様凝集体であるかどうかをテストするために、Tau441 を Atto647N で標識し、最初から 12.5 μM アミロイド特異的チオフラビン T (ThT) を添加する CF 顕微鏡を使用して同様の実験を実行しました。染料。αS / Tau441液滴またはラフトのThT染色は、24時間のインキュベーション後でも観察されませんでしたが（図5b、上の行-タンパク質ラフト上の残りの液滴）、ラフト内のAtto647N-Tau441を含むThT陽性構造は非常に弱かった。これは、以前に説明されたスポットのサイズ、形状、および位置を再現しており（図5b、中段と下段）、これらのスポットが老化した流体コアセルベートで形成されたアミロイド様凝集体に対応している可能性があることを示唆しています。
LLPS バッファーを含む顕微鏡プレートのウェル中の 25 μM Tau441 (1 μM AF488 標識 αS および Atto647N 標識 Tau441) の存在下で、さまざまなインキュベーション時間および焦点高さ (z、非結合底からの距離) での 25 μM αS の WF 。6 つの実験を独立して繰り返しましたが、同様の結果が得られました。b 25 μM Tau441 (1 μM Atto647N 標識 Tau441) および 12.5 μM チオフラビン-T (ThT) の存在下での 25 μM αS の CF 顕微鏡画像。重み付けされたタンパク質液滴と、堆積したタンパク質ラフトおよびスポットが、それぞれ上段と中段に示されています。下の行は、3 つの独立した複製からのラフトとドロップの画像を示しています。白い矢印は、両方のパネルの ThT 陽性のドットを示します。すべての画像のスケール バーは 20 μm です。
液体から固体への移行中のコアセルベートタンパク質ネットワークの変化をより詳細に調べるために、蛍光寿命イメージング（FLIM）とフェルスター共鳴エネルギー移動顕微鏡法（FRET）を使用しました（図6および補足図8および9）。我々は、コアセルベート層がより凝縮した、または固体のような凝集タンパク質構造に成熟すると、タンパク質とそれに結合した蛍光プローブとの接触が緊密になり、プローブ寿命（τ）の短縮に現れる消光効果が生じる可能性があると仮説を立てました。 、前述したように40。、41、42。さらに、二重標識サンプル (それぞれ FRET ドナー色素とアクセプター色素としての AF488 と Atto647N) の場合、この τ の減少は、LSPT 中のコアセルベート縮合と FRET(E) 効率の増加を伴う可能性もあります。LLPS αS/Tau441 および αS/ΔNt-Tau サンプル (1 μM AF488 標識 αS および/または Atto647N 標識 Tau441 または ΔNt-Tau を含む LLPS 緩衝液中の各タンパク質 25 μM) におけるラフトおよびスポットの形成を経時的にモニタリングしました。コアセルベートが成熟するにつれて、AF488（τ488）およびAtto647N（τ647N）プローブの蛍光寿命がわずかに減少するという一般的な傾向を観察しました（図6および補足図8c）。興味深いことに、この変化はラフト内のドットで大幅に強化され（図6c）、ドットでさらなるタンパク質の凝縮が起こったことを示しています。これを裏付けるように、24時間エージングしたαS / ΔNt-Tau液滴では蛍光寿命の有意な変化は観察されず（補足図8d）、液滴のゲル化はスポッティングとは異なるプロセスであり、重大な分子再構成を伴わないことを示唆していますコアセルベート内。αS、特にαS/Tau441システムの場合、ドットのサイズと内容が異なることに注意してください（補足図8e）。スポット蛍光寿命の減少には、特にAtto647N標識Tau441（補足図8a）の強度の増加と、αS / Tau441およびαS / ΔNt-Tauシステムの両方のFRET効率の向上が伴い、LLPS 5時間でのさらなる凝縮が示されました。トリガー後、静電気内部のタンパク質が凝縮します。αS/ΔNt-Tauと比較して、αS/Tau441スポットではより低いτ647Nとやや高いτ488値が観察され、より低くより不均一なFRET値が伴いました。おそらく、これは、αS / Tau441系では、タウ441自体もLLPSおよび凝集を受ける可能性があるため、凝集体中の観察および予想されるαS存在量がより不均一であり、多くの場合、タウと比較して準化学量論的であるという事実に関連している可能性があります（補足図8e）。 。しかし、液滴合体、ラフト形成、そして重要なことに、液体状コアセルベート内のタンパク質凝集の程度は、Tau441 と αS の両方が存在する場合に最大になります。
a LLPSバッファー中の25μMの各タンパク質（1μM AF488標識αSおよび1μM Atto647N標識Tau441またはΔNt-Tau）のαS / Tau441およびαS / ΔNt-Tauの生涯蛍光顕微鏡（FLIM）画像。列は、さまざまな成熟時間 (30 分、5 時間、および 24 時間) での LLPS サンプルの代表的な画像を示しています。赤枠はαS/Tau441スポットを含む領域を示します。寿命はカラーバーで表示されます。すべての画像のスケール バー = 20 μm。b 選択した領域の拡大 FLIM 画像。パネル a の赤いボックスに表示されます。寿命範囲は、パネル a と同じカラー スケールを使用して表示されます。スケールバー = 5 μm。c αS-について記録されたFLIM画像で特定された、さまざまなタンパク質種（液滴-D-、ラフト-R-、およびスペックル-P）のAF488（αSに結合）またはAtto647N（タウに結合）を示すヒストグラム）、Tau441およびTau441およびTau441のタイミング分布の寿命αS/ΔNt-Tau コアセルベート サンプル (N = D の場合は 17 ～ 32 ROI、R の場合は 29 ～ 44 ROI、および点の場合は 21 ～ 51 ROI)。平均値と中央値は、それぞれボックス内の黄色の四角と黒い線で表示されます。ボックスの下限と上限はそれぞれ第 1 四分位数と第 3 四分位数を表し、1.5 倍の四分位範囲 (IQR) 内の最小値と最大値がひげとして表示されます。外れ値は黒いひし形で表示されます。分布ペア間の統計的有意性は、不等分散を仮定した 2 サンプル t 検定を使用して決定されました。両側 t 検定の p 値は、比較されたデータの各ペアについてアスタリスクで表示されます (* p 値 > 0.01、** p 値 > 0.001、*** p 値 > 0.0001、**** p 値 > 0.00001)、ns は無視できることを示します (p 値 > 0.05)。正確な p 値は補足表 1 に示されており、元のデータは生データ ファイルとして示されています。
スペックル/凝集体のアミロイド様の性質をさらに実証するために、未染色のコアセルベートサンプルを高濃度（1 M）NaClで24時間処理しました。これにより、タンパク質コアセルベートから凝集体が分離されました。原子間力顕微鏡 (AFM) を使用して分離された凝集体 (つまり、凝集体の分散溶液) を観察すると、約 15 nm の規則的な高さを持つ主に球形の形態が観察されました。これは、高塩濃度の条件下で会合する傾向があります。表面の強い疎水効果による典型的なアミロイドフィブリルの挙動（フィブリルの高さは通常〜10 nmであることに注意してください）（補足図10a）。興味深いことに、単離された凝集体を標準的なThT蛍光アッセイでThTとインキュベートすると、色素を典型的なαSアミロイドフィブリルとインキュベートしたときに観察されたものに匹敵する、ThT蛍光量子収量の劇的な増加が観察されました（補足図10b）。コアセルベート凝集体にはアミロイド様構造が含まれています。。実際、凝集体は、典型的なアミロイド原線維と同様に、高塩濃度には耐性がありましたが、4 M 塩化グアニジン（GdnHCl）には敏感でした（補足図10c）。
次に、単一分子蛍光、特異的蛍光相関/相互相関分光法 (FCS/FCCS)、および 2 色同時計数検出 (TCCD) のバースト分析を使用して、凝集体の組成を分析しました。この目的を達成するために、本発明者らは、αSおよびTau441（両方とも25μM）を1μMのAF488標識αSおよび1μMのAtto647N標識Tau441とともに含む100μlのLLPSサンプル中で24時間インキュベートした後に形成された凝集体を単離した。LLPS とタンパク質の間で起こり得る静電相互作用を防ぐために、同じ PEG フリー緩衝液と 1 M NaCl (コアセルベートから凝集体を分離するために使用されるのと同じ緩衝液) を使用して、得られた分散凝集溶液を単分子状態に希釈します。単一分子の時間軌跡の例を図 7a に示します。FCCS/FCS 分析 (相互相関、CC および自己相関、AC) は、αS およびタウを含む凝集体がサンプル中に豊富に存在し (図 7b、左パネルの CC 曲線を参照)、過剰な残留単量体タンパク質が発生したことを示しました。希釈プロセスの結果 (図 7b、左パネルの AC 曲線を参照)。単量体タンパク質のみを含むサンプルを使用して同じ溶液条件下で実行された対照実験では、CC曲線は示されず、AC曲線は単量体タンパク質が予想される拡散係数を有する一成分拡散モデル（式4）によく適合しました（図7b）。 )、右パネル)。凝集粒子の拡散係数は 1 µm2/s 未満で、単量体タンパク質の拡散係数は約 1 µm2/s です。50〜100μm/秒。この値は、同様の溶液条件下で別々に超音波処理したαS アミロイド原線維と単量体 αS について以前に公表された値と同様です 44。TCCD爆発解析で凝集体を分析したところ（図7c、上のパネル）、単離された各凝集体（αS/タウヘテロ凝集体）では、検出された凝集体の約60％がαSとタウの両方を含み、約30％がαSとタウのみを含むことがわかりました。タウ、約 10% αS のみ。αS/タウヘテロ凝集体の化学量論分析では、ほとんどのヘテロ凝集体はタウが豊富であることが示されました（化学量論は0.5未満、凝集体あたりのタウ分子の平均数はαS分子の4倍です）。これは、FLIM in situで観察された我々の研究と一致しています。実験。。FRET分析により、これらの凝集体には両方のタンパク質が含まれていることが示されましたが、この場合の実際のFRET値はそれほど重要ではありません。これは、実験で使用した標識されていないタンパク質が過剰であるため、各凝集体中の蛍光団の分布がランダムであったためです。興味深いことに、45,46成熟アミロイド凝集欠損タウバリアントを使用して同じ分析を実行したとき（補足図11a、bを参照）、αS静電凝集は同じであるにもかかわらず（補足図11c、d）、コアセルベート内で凝集体を形成する能力は大幅に低下し、FLIM はその場実験でいくつかのスポットを検出し、分離された凝集体サンプルでは弱い相互相関曲線が観察されました。しかし、検出された少数の凝集体 (Tau441 のわずか 10 分の 1) では、各凝集体がこのタウ変異体よりも αS が豊富で、検出された凝集体の約 50% が αS 分子のみを含み、αS が過剰に不均一であることが観察されました。 。Tau441によって生成された不均一な凝集体（図6f）とは対照的に、凝集体（補足図11eを参照）。これらの実験の結果は、αS自体はコアセルベート内でタウとともに蓄積することができるが、これらの条件下ではタウの核形成がより有利であり、結果として生じるアミロイド様凝集体がαSおよびタウの形態として機能できることを示した。しかし、タウに富んだコアが形成されると、凝集体ではタウ分子間の同型相互作用よりもαSとタウの間の異型相互作用が優先されます。また、液体のαS/タウコアセルベート中のタンパク質ネットワークも観察しました。
a αS/Tau441静電コアセルベートで形成された単離された凝集体の単一分子の代表的な蛍光の時間的トレース。αS/Tau441 共凝集体に対応するバースト (示された閾値を超えるバースト) が 3 つの検出チャネル (直接励起後の AF488 および Atto647N 発光、青および赤の線、間接励起後の Atto647N 発光)、FRET、紫線) で観察されました。b LLPSから得られた単離されたαS / Tau441凝集体のサンプルのFCS / FCCS分析（左パネル）。AF488 および Atto647N の自己相関 (AC) 曲線はそれぞれ青と赤で示され、両方の色素を含む凝集体に関連する相互相関 (CC) 曲線は紫で示されます。AC 曲線は、標識された単量体および凝集タンパク質種の存在を反映していますが、CC 曲線は二重標識凝集体の拡散のみを示しています。同じ分析ですが、孤立したスポットと同じ溶液条件下で、単量体 αS および Tau441 のみを含むサンプルを右パネルにコントロールとして示します。c αS/Tau441静電コアセルベートで形成された単離された凝集体の単一分子の蛍光フラッシュ分析。4 つの異なるリピート (N = 152) で見つかった各凝集体の情報を、化学量論、S 値、および FRET 効率に対してプロットします (上のパネル、カラー バーは発生を反映します)。3 種類の凝集体を区別できます: S~1 および FRET~0 を含むαS のみの凝集体、S~0 および FRET~1 を含むタウのみの凝集体、および中間の S および FRET を含む不均一なタウ/αS 凝集体。各不均一凝集体 (N = 100) で検出された両方のマーカータンパク質を下のパネルに示します (カラー スケールは発生を反映しています)。生データは生データ ファイルの形式で提供されます。
液体タンパク質の凝縮物が時間の経過とともにゲル状または固体の構造に成熟または老化することは、アミロイド凝集に先立つ異常なプロセスとして、凝縮物のいくつかの生理学的機能 47 および疾患に関与していることが報告されています 7、48、49。私たちは相分離と挙動を詳細に研究しています。LSPT αS は、低マイクロモル濃度の制御された環境および生理学的に適切な条件下でランダム ポリカチオンの存在下で行われます (αS の生理学的濃度の計算値は 1 μM を超えることに注意してください)。LPS の典型的な熱力学的挙動に従います。我々は、生理学的pHで高度に負に帯電したC末端領域を含むαSが、pLKやタウなどの高度にカチオン性の無秩序なペプチドの存在下で、静電プロセスを通じてLLPSを介して水溶液中でタンパク質に富んだ液滴を形成できることを発見しました。凝集高分子の存在下での複雑な縮合。このプロセスは、αS が in vitro および in vivo の両方でその疾患に関連した凝集に関連するさまざまなポリカチオン性分子に遭遇する細胞環境に関連する効果をもたらす可能性があります 51,52,53,54。
多くの研究では、液滴内のタンパク質の動態が成熟プロセスを決定する重要な要素の 1 つと考えられています 55,56。ポリカチオンを含む静電αSコアセルベートでは、成熟プロセスは明らかにポリカチオンとの相互作用の強さ、原子価、およびこれらの相互作用の多重度に依存します。平衡理論は、2 つの液体状態の平衡状態は、LLPS を駆動する生体高分子が豊富に含まれる大きな液滴の存在であることを示唆しています 57,58。液滴の成長は、オストワルド成熟 59、合体 60、または分散相中の遊離モノマーの消費 61 によって達成できます。αS および Tau441、ΔNt-Tau または pLK の場合、この研究で使用した条件下では、ほとんどのタンパク質が凝縮液中に濃縮されました。しかし、フルサイズのタウ液滴は表面が濡れると急速に合体するのに対し、ΔNt-Tau と pLK では液滴の合体と湿潤が困難であり、これら 2 つの系では液体特性が急速に失われることが示唆されています。FLIM-FRET 分析によると、老化した pLK および ΔNt-Tau 液滴は、元の液滴と同程度のタンパク質凝集 (同様の蛍光寿命) を示し、元のタンパク質ネットワークがより強固ではあるものの保持されていることを示唆しています。
次のモデルで実験結果を合理化します (図 8)。最初に一時的に形成される液滴は、多くの場合、静電補償のないタンパク質ネットワークであるため、特に液滴界面に電荷の不均衡領域が存在し、その結果、液滴の表面静電電位が高くなります。電荷（一般に価数減少と呼ばれる現象）を補償し、液滴の表面電位を最小限に抑えるために、液滴には希釈相からの新しいポリペプチドが含まれ、タンパク質ネットワークを再編成して電荷-電荷相互作用が最適化され、他の液滴と相互作用することができます。表面（濡れ）あり。αS/pLK 液滴は、そのより単純なタンパク質ネットワーク (αS と pLK 間の異型相互作用のみ) とタンパク質間相互作用に対するより高い親和性により、凝縮液の電荷のバランスをより迅速にとれるようです。実際、最初に形成されたαS/pLKコアセルベートでは、αS/Tauよりも速いタンパク質動態が観察されました。原子価が枯渇すると、相互作用は一時的ではなくなり、液滴は液体の性質を失い、表面静電電位が低い (したがって表面を濡らすことができない) ゲル状の不燃性液滴に変わります。対照的に、αS/Tau 液滴は、より複雑なタンパク質ネットワーク (同型相互作用と異型相互作用の両方を含む) とタンパク質相互作用の性質が弱いため、液滴の電荷バランスの最適化の効率が低くなります。これにより、液滴は長期間にわたって液体の挙動を保持し、高い静電表面電位を示します。この静電表面電位は、合体および成長 (したがって液滴の表面積/体積比が最小化される) および親水性表面化学物質を濡らすことによって最小化される傾向があります。これにより、タンパク質ネットワーク内の電荷の最適化が絶え間なく探索されるため、相互作用は非常に一時的なままであるため、流体特性を保持する大規模な濃縮タンパク質ライブラリが作成されます。興味深いことに、いくつかの天然に存在するアイソフォーム 62 を含むタウの N 末端切断型は中間的な挙動を示し、一部のコアセルベートはαS とともに老化して長寿命のゲル状液滴になる一方、他のコアセルベートは大きな液体凝縮物に変化します。αS 静電コアセルベートの成熟におけるこの二重性は、凝縮液のサイズと流体特性を制御するための鍵として、凝縮液における価数枯渇と静電ふるいの間の相関関係を特定した最近の LLPS の理論的および実験的研究と一致しています。メカニズム58.61。
このスキームは、LLPS および LSPT を介した αS および Tau441 の推定上のアミロイド凝集経路を示しています。追加のアニオンリッチ (赤色) およびカチオンリッチ (青色) 領域により、満足のいく価数を持つ αS およびタウ静電コアセルベートは表面エネルギーが低くなり、したがって合体が少なくなり、液滴の急速な老化が起こります。安定した凝集のないゲル状態が得られます。。αS/pLK システムの場合、その高い親和性とより単純なタンパク質ペア相互作用ネットワークにより、高速なゲル状転移が可能になるため、この状況は非常に有利です。逆に、原子価が不十分な液滴、つまり相互作用に利用できるタンパク質荷電領域があると、コアセルベートが融合しやすくなり、親水性表面を濡らし、その高い表面エネルギーを低下させます。この状況は、弱いタウ-タウ相互作用およびαS-タウ相互作用からなる多価の複雑なネットワークを有するαS/タウ441コアセルベートにとって好ましい。次に、より大きなコアセルベートは、その流体のような特性をより容易に保持し、他のタンパク質間相互作用が起こることを可能にします。最終的に、αSとタウの両方を含むアミロイドの不均一凝集体がコアセルベート液内に形成されますが、これは神経変性疾患の特徴である封入体に見られる凝集体に関連している可能性があります。
高度に混雑しているが動的なタンパク質環境を伴うαS/Tau441の成熟中に形成される大きな流体様構造、および程度は低いがαS/ΔNt-Tauコアセルベートは、タンパク質凝集の核形成にとって理想的な貯蔵庫である。我々は実際に、このタイプのタンパク質コアセルベートにおいて、多くの場合αSとタウの両方を含む固体タンパク質凝集体の形成を観察しました。我々は、これらのヘテロ凝集体が非静電相互作用によって安定化し、典型的なアミロイド原線維と同じ方法でアミロイド特異的ThT色素に結合することができ、実際にさまざまな影響に対して同様の耐性を有することを示した。LLPSによって形成されるαS/タウ凝集体は、アミロイド様の特性を有することが示された。実際、アミロイド凝集が欠損したタウの成熟変異体は、液体静電コアセルベート内でのこれらの不均一なαS凝集体の形成が著しく損なわれています。αS/Tau441 凝集体の形成は、液体のような性質を保持しているコアセルベートの内部でのみ観察され、コアセルベート/液滴がゲル状態に達しない場合には観察されませんでした。後者の場合、静電相互作用の強度が増大し、その結果としてタンパク質ネットワークが硬直するため、アミロイド核形成に必要な新しいタンパク質相互作用を確立するために必要なタンパク質の立体構造再配置が妨げられます。しかし、これはより柔軟な液体状のコアセルベートで実現でき、サイズが大きくなっても液体のままである可​​能性が高くなります。
凝縮相内での凝集体の形成は、急速にゲル化する小さな液滴よりも大きなαS/Tau凝縮物の方が好ましいという事実は、液滴の合体を制御する因子を特定することの関連性を強調しています。したがって、相分離の傾向があるだけでなく、病気の予防だけでなく適切な機能のためにも凝縮物のサイズを制御する必要があります58,61。私たちの結果は、αS/Tau システムにおける LLPS と LSPT の間のバランスの重要性も強調しています。他のシステムで提案されているように、液滴形成は飽和条件下で利用可能なタンパク質モノマーの量を減らすことによってアミロイド凝集を防ぐ可能性がありますが、63、64、高液滴レベルでの液滴融合は、遅い立体構造再配列を通じて内部タンパク質凝集を引き起こす可能性があります。タンパク質のネットワーク。。
全体として、私たちのデータは、LSPT の文脈におけるドロップ ネットワークにおける凝集価数と満足/不満足の相互作用の関連性を強く強調しています。特に、全長αS/Tau441凝縮体が効率的に融合および核形成して、両方のタンパク質を含むアミロイド様ヘテロ凝集体を形成できることを示し、実験結果に基づいた分子機構を提案します。私たちがここで報告するαS/タウ流体コアセルベートにおける2つのタンパク質の共凝集は、実際、この疾患の特徴である封入体における2つのタンパク質の共局在に関連している可能性があり、LLPSとLLPSの関係の理解に貢献する可能性があります。アミロイド凝集、神経変性における高度に帯電した IDP への道を開く。
単量体 WT-αS、システイン変異体 (Q24C-αS、N122C-αS) およびΔCt-αS 変異体 (Δ101-140) を大腸菌で発現させ、前述のように精製しました。ジスルフィド結合の形成を防ぐために、αS システイン変異体の精製のすべてのステップに 5 mM DTT が含まれています。Tau441 アイソフォーム (Addgene #16316 から得たプラスミド)、ΔNt-Tau バリアント (Δ1-150、プライマー CTTTAAGAAGGAGATACATATGATCGCCACACCGCGG、CATATGTATATCCTCTCTTCTTAAAGTTAAAC で IVA をクローニングして得た)、および AggDef-Tau バリアント (Δ275-311、GGCTC5 プライマーで精製) の大腸菌培養物を使用しました。 37℃、180 rpm で OD600 = 0.6 ～ 0.7 まで増殖させ、IPTG を使用して 37℃ で 3 時間発現を誘導しました。4 °C で 15 分間 11,500 xg で細胞を収集し、150 mM NaCl を含む生理食塩水バッファーで洗浄します。ペレットを溶解バッファー (1 L LB あたり 20 ml: MES 20 mM、pH 6.8、NaCl 500 mM、EDTA 1 mM、MgCl2 0.2 mM、DTT 5 mM、PMSF 1 mM、ベンズアミジン 50 μM、コペプチン 100 μM) に再懸濁します。超音波処理ステップは、氷上で振幅 80%、パルス 10 回 (1 分間オン、1 分間オフ) で実行されました。1 回の超音波検査で 60 ml を超えないようにしてください。大腸菌溶解物を95℃で20分間加熱し、次に氷上で冷却し、127,000×gで40分間遠心分離した。清澄化した上清を 3.5 kDa 膜 (Spectrum™ Thermo Fisher Scientific、英国) に適用し、4 L の透析バッファー (20 mM MES、pH 6.8、NaCl 50 mM、EDTA 1 mM、MgCl2 2 mM、DTT 2 mM) に対して透析しました。 、ＰＭＳＦ ０．１ｍＭ）を１０時間。5 ml 陽イオン交換カラム (HiTrap SPFF、Cytiva、MA、USA) を平衡緩衝液 (20 mM MES、pH 6.8、50 mM NaCl、1 mM EDTA、2 mM MgCl2、2 mM DTT、0.1 mM PMSF) で平衡化しました。タウ溶解物を０．２２μｍのＰＶＤＦフィルターを通して濾過し、流速１ｍｌ／分でカラムに注入した。溶出は徐々に実行され、タウは 15 ～ 30% の溶出緩衝液 (20 mM MES、pH 6.8、1 M NaCl、1 mM EDTA、2 mM MgCl2、2 mM DTT、0.1 mM PMSF) で溶出しました。画分をSDS-PAGEで分析し、タウの予想分子量を有する1つのバンドを含む画分を10 kDaの遠心分離フィルターを使用して濃縮し、10 mM HEPES、pH 7.4、NaCl 500 mMおよびDTT 2 mMを含む緩衝液で置き換えました。最終タンパク質濃度は100μMでした。次にタンパク質溶液を 0.22 μm PVDF フィルターに通し、急速凍結して -80℃ で保存しました。プロテイン K18 は、Alberto Boffi 教授のご厚意により提供されました。調製物の純度は、SDS-PAGE および MALDI-TOF/TOF で確認したところ、>95% でした。さまざまなシステインを、AlexaFluor488 マレイミド (AF488、ThermoFisher Scientific、米国マサチューセッツ州ウォルサム) または TEMPOL マレイミド (Toronto Research Chemicals、カナダ、トロント) で化学標識しました。吸光度および MALDI-TOF/TOF によって確認されました。Tau441、ΔNt-Tau、AggDef-Tau、および K18 を、同じ手順に従って、Atto647N-マレイミド (ATTO-TEC GmbH、ジーゲン、ドイツ) を使用して、191 位および 322 位で天然のシステイン残基で標識しました。αS および Tau441 の残基あたりの正味電荷マップは、CIDER66 を使用して生成されました。
固体ポリ-L-リジン（米国アラバマ州ハンツビルのAlamanda Polymers Incの供給業者からのNMRによるpLK DP 90-110）を10 mM HEPES、100 mM NaCl、pH 7.4に溶解して10 mM濃度にし、5分間超音波処理しました。超音波ウォーターバスに数分間浸し、-20°C で保管します。PEG-8、デキストラン-70、FITC-PEG-10 (Biochempeg、米国マサチューセッツ州ウォータータウン)、および FITC-デキストラン-500 (Sigma -Aldrich、米国ミシガン州サンルイス) は水溶性であり、LLPS 緩衝液に広く分布しています。透析により汚染塩が除去されます。次に、それらを孔径 0.22 μm のシリンジフィルターで濾過し、屈折計 (Mettler Toledo、米国オハイオ州コロンバス) を使用して濃度を計算しました。LLPS サンプルは、次の順序で室温で調製しました。バッファーと押出物を混合し、1 mM トリス(2-カルボキシエチル) ホスフィン (TCEP、Carbosynth、英国コンプトン)、1 mM 2,2,2,2-(エタン- １，２－ジイルニトリル）四酢酸（ＥＤＴＡ、カルボシント）および１％プロテアーゼ阻害剤（ＰＭＳＦ １００ｍＭ、ベンズイミド１ｍＭ、ロイペプチン ５μＭ）の混合物。次に、αS および融合ポリカチオン (オプション pLK または Tau) が追加されます。チオフラビン T 時系列実験 (ThT、Carbosynth、コンプトン、英国) の場合、合計 ThT 濃度が αS 濃度の半分になるように使用します。サンプルが均一であることを確認するために、サンプルを穏やかに、しかし徹底的に混合します。「結果」セクションで説明したように、各成分の濃度は実験ごとに異なりました。実験時間が 4 時間を超える場合は常に、アジドを 0.02% (w/v) の濃度で使用しました。LLPS サンプルを使用するすべての分析では、分析前に混合物を 5 分間平衡化させます。光散乱分析では、150 μl のサンプルを非結合 96 ウェルマイクロプレート (μClear®、黒、F-Bottom/Chimney Well、Greiner bio-one、クレムスミュンスター、オーストリア) にロードし、粘着フィルムで覆いました。LLPは、CLARIOstarプレートリーダー(BMG Labtech、Ortenberg、Germany)で溶液の中心における350nmの吸光度を測定することによってモニタリングした。実験は 25℃で 3 回行い、誤差は平均値からの標準偏差として計算されました。希釈相はサンプルの遠心分離と SDS-PAGE ゲル分析によって定量され、希釈相と濃縮相の αS 画分はさまざまな LLPS 溶液で定量されました。１μＭのＡＦ４８８標識αＳを含有する１００μｌのＬＬＰＳサンプルを、完全に混合し、続いて９６００×ｇで３０分間遠心分離することによって調製した。その後、通常、沈殿が目に見えるようになった。上清の上部 50 μl を、SDS-PAGE ゲルを使用したタンパク質の定量に使用しました。ゲルは、ChemiDoc ゲルイメージング システム (Bio-Rad Laboratories、Hercules、CA、USA) を使用して AF488 フィルターでスキャンするか、クーマシー染色で染色し、適切なフィルターで視覚化しました。得られたバンドは、ImageJ バージョン 1.53i (米国国立衛生研究所) を使用して分析しました。実験は 2 つの異なる実験で二重に実行され、同様の結果が得られました。
通常、150μlのサンプルを非結合96ウェルマイクロプレートに適用し、室温でLeica DMI6000B倒立顕微鏡（Leica Microsystems、Wetzlar、ドイツ）で視覚化しました。スポット実験には、μ-Slide Angiogenesis プレート (Ibidi GmbH、ドイツ、グレーフェルフィング) または 96 ウェルポリスチレンマイクロプレート (Corning Costar Corp.、マサチューセッツ州アクトン) も使用しました。EL6000 ハロゲンまたは水銀メタルハライド ランプを照明源として使用しました (それぞれ BF/DIC および WF イメージング用)。WF 顕微鏡検査では、倍率 40 倍の空気対物レンズ (Leica Microsystems、ドイツ) を使用してサンプルに光を集中させ、収集しました。AF488 および ThT 標識サンプルの場合、標準 GFP フィルター セット、励起および発光バンドパス フィルター、それぞれ 460 ～ 500 nm および 512 ～ 542 nm バンドパス フィルター、および 495 nm ダイクロイック ミラーを使用して励起および発光をフィルターします。Atto647N で標識されたサンプルの場合、それぞれ 628 ～ 40 nm および 692 ～ 40 nm の励起バンドパス フィルターと 692 ～ 40 nm の発光バンドパス フィルターを備えた Cy5 フィルターの標準セットと、660 nm のダイクロイック ミラーが使用されました。BF 顕微鏡と DIC 顕微鏡では、同じ反射光収集対物レンズを使用します。収集された光は、Leica DFC7000 CCD カメラ (Leica Microsystems、ドイツ) で記録されました。露光時間は、BF および DIC 顕微鏡イメージングの場合は 50 ms、WF 顕微鏡イメージングの場合は 20 ～ 100 ms でした。比較のために、ThT を使用したすべての実験の露光時間は 100 ミリ秒でした。微速度撮影実験は、液滴の合体を視覚化するために実行され、数分間にわたって 100 ミリ秒ごとに画像が収集されました。画像解析には ImageJ (NIH、米国) を使用しました。実験は３回実行され、同様の結果が得られた。
共局在実験、FRAP、および 3D 再構成では、ZEN 2 ブルー エディション (Carl Zeiss AG、オーバーコッヘン、ドイツ) を使用して Zeiss LSM 880 倒立共焦点顕微鏡で画像を取得しました。50 µl のサンプルを µ-Slide Angiogenesis ペトリ皿 (Ibidi GmbH、Gröfelfing、ドイツ) に適用し、親水性ポリマー (ibiTreat) で処理し、63 倍の油浸対物レンズ (Plan-Apochromat 63x/NA 1.4 Oil) に取り付けました。 DIC）。画像は、458 nm、488 nm、および 633 nm のアルゴン レーザー ラインを使用して、解像度 0.26 μm/ピクセル、露光時間 8 μs/ピクセル、励起および発光検出ウィンドウ 470 ～ 600 nm、493 ～ 628 nm、 ThT、AF488、Atto647N をそれぞれ可視化するために 638 ～ 755 nm を使用しました。FRAP 実験では、各サンプルのタイムラプス写真を 1 秒あたり 1 フレームで記録しました。実験は室温で 3 回実行され、同様の結果が得られました。すべての画像は、Zen 2 ブルー エディション ソフトウェア (Carl Zeiss AG、オーバーコッヘン、ドイツ) を使用して分析されました。FRAP 曲線は、OriginPro 9.1 を使用して Zen 2 を使用して画像から抽出された強度/時間データに正規化され、プロットされ、フィッティングされました。回復曲線は、獲得漂白効果を説明する追加の指数項を使用して分子拡散を説明する単一指数モデルに適合させました。次に、Kang らの式のように、公称漂白半径と以前に決定した回復半減期を使用して D を計算しました。5 35を表示しています。
αS の単一システイン変異体は、24 位 (TEMPOL-24-αS) および 122 位 (TEMPOL-122-αS) で 4-ヒドロキシ-2,2,6,6-テトラメチルピペリジン-N-オキシル (TEMPOL) を使用して合成されました。それぞれ。スピン標識 EPR 実験では、αS 濃度を 100 μM に設定し、PEG 濃度を 15% (w/v) に設定しました。さまざまな凝集条件において、αS:pLK 比は 1:10 でしたが、αS:ΔNt-Tau および αS:Tau441 比は 1:1 に維持されました。クラウディングの非存在下での結合滴定実験では、TEMPOL-122-αS を 50 μM に維持し、ポリカチオンを濃度を増加させて滴定し、各条件を個別に準備しました。CW-EPR 測定は、〜9.7 GHz のマイクロ波 (SHF) 周波数で動作する Bruker ER4118 SPT-N1 共振器を備えた Bruker ELEXSYS E580 X バンド分光計を使用して実行されました。温度は 25°C に設定され、液体窒素クライオスタットによって制御されました。スペクトルは、MW パワー 4 mW、変調振幅 0.1 mT、変調周波数 100 kHz の不飽和条件下で得られました。スペクトル強度は、サンプル間のスピン濃度の違いと、Tau441 または ΔNt-Tau (元のタンパク質溶液に存在する) を含むサンプル中の還元剤の残留濃度によるスピン減少の可能性を避けるために正規化されました。与えられた g の値は、Matlab®67 に実装された Easyspin ソフトウェア (v. 6.0.0-dev.34) を使用して実行された EPR スペクトル モデリングの結果として取得されました。1/2 成分等方性モデルを使用してデータをモデル化しました。すべての信号を正規化した後、対応する実験スペクトルから各シミュレーションを差し引くことによって残差が計算されました。結合滴定分析では、正規化 EPR スペクトルの 2 番目のバンドに対する 3 番目のバンドの相対強度 (IIII/III) を使用して、αS へのポリカチオンの結合をモニタリングしました。解離定数 (Kd) を推定するために、得られた曲線を n 個の同一かつ独立した結合部位を仮定した近似モデルに当てはめました。
ＮＭＲ分光実験は、凍結プローブおよびＺ勾配を備えたＢｒｕｋｅｒ Ｎｅｏ ８００ＭＨｚ（１Ｈ）ＮＭＲ分光計を使用して実施した。すべての実験は、10 mM HEPES、100 mM NaCl、10% DO、pH 7.4 中の 130 ～ 207 μM αS および対応する αS/ΔNt-Tau および pLK 等価物を使用して実行され、15°C で実行されました。NMR で LPS を監視するために、10% PEG をプレミックスサンプルに添加しました。化学シフト摂動プロット (図 1b) は、平均 1H および 15N 化学シフトを示しています。αS 2D1H-15N HSQC スペクトルは、以前の割り当て (BMRB エントリー #25227) に基づいて割り当てられ、HNCA、HNCO、および CBCAcoNH の 3D スペクトルを記録および分析することによって確認されました。13Cαおよび13Cβの化学シフトは、ΔNt-TauまたはpLKの存在下で計算され、純粋なランダムコイル立体構造68のαS化学シフトと比較して二次構造傾向の起こり得る変化を測定しました（補足図5c）。R1ρ レートは、8、36、76、100、156、250、400、および 800 ミリ秒の遅延で hsqctretf3gpsi 実験 (Bruker ライブラリから取得) を記録することによって測定され、指数関数はさまざまな時点でのピーク強度遅延に調整されました。 R1ρ とその実験的不確実性を決定するのに 1 回かかります。
2 色時間分解蛍光顕微鏡実験は、時間相関単一光子計数 (TCSPC) デバイスを備えた市販の時間分解 MT200 蛍光共焦点顕微鏡 (PicoQuant、ベルリン、ドイツ) で実行されました。レーザー ダイオード ヘッドはパルス インターリーブ励起 (PIE) に使用され、ビームはシングル モード導波路を通過し、ダイクロイック ミラーの後に測定される 481 nm および 637 nm のレーザー ラインに対して 10 ～ 100 nW のレーザー パワーに調整されます。これにより、最適なフォトン計数率が保証され、フォトンのエイリアシング、光退色、飽和の影響が回避されます。μ-Slide 血管新生カバースリップまたはプレート (Ibidi GmbH、Gräfelfing、ドイツ) を、補正カラーを備えた Super Apochromat 60x NA 1.2 レンズ (Olympus Life Sciences、ウォルサム、米国) 上の浸漬水中に直接配置しました。488/640 nm のダイクロイック ミラー (Semrock、米国イリノイ州レイク フォレスト) をメイン ビーム スプリッターとして使用しました。焦点の合っていない放射線は直径 50 ミクロンの穴によってブロックされ、その後、焦点の合った放射線は 50/50 ビーム スプリッターによって 2 つの検出パスに分割されます。検出器の前に、緑色色素 (AF488) 用のバンドパス放射フィルター (米国イリノイ州レイクフォレスト、Semrock) 520/35 および赤色色素 (Atto647N) 用の 690/70 を使用しました。単一光子アバランシェ ダイオード (SPAD) (Micro Photon Devices、ボルツァーノ、イタリア) を検出器として使用しました。データ収集と分析は両方とも、市販の SymphoTime64 ソフトウェア (PicoQuant GmbH、ベルリン、ドイツ) を使用して実行されました。
50 マイクロリットルの LLPS サンプルをμ-Slide 血管新生ウェル (Ibidi GmbH、Gräfelfing、ドイツ) に適用しました。結果として得られる画像は、浮遊液滴の最適な対物作動距離を実現するためにウェルの底から 20 µm 上に焦点を合わせ、少なくとも 0.25 µm/ピクセルの軸分解能と 400 µs/ピクセルの遅延時間でラフトおよびドットの場合は ~1 µm に焦点を合わせます。各チャネルの平均バックグラウンド信号強度 (PBG、平均 + 2σ) に基づく強度しきい値を適用してデータを選択し、液体タンパク質の液滴、ラフト、またはスポットのみが選択され、分散相から発生源の可能性があるものを除外します。各チャネル（AF488の場合は緑、「g」、Atto647Nの場合は赤、「r」）の各種の寿命（τ）を分析するために、液滴、ラフト、またはスポットを含む関心領域（ROI）を選択しました（補足図1） ）。8b）、テールフィット解析と2成分減衰モデルを使用して、各チャネルの寿命減衰（液滴、ラフト、またはスポットのそれぞれτD、τR、およびτP、補足図8cを参照）をフィッティングすることによってそれらを導き出しました。τ からの平均 τ 。生成した光子が多指数関数フィットに対して少なすぎる ROI は分析から除外されました。使用されたカットオフは、ラフトとドットでは <104 フォトン、ドロップでは 103 フォトンでした。画像フィールド内の液滴は通常より小さく、数も少ないため、より高い強度値の減衰曲線を取得するのが難しいため、液滴のしきい値は低くなります。フォトン蓄積限界 (>500 カウント/ピクセルに設定) を超えるフォトン カウントを持つ ROI も分析のために破棄されました。対象領域から取得した強度減衰曲線を耐用年数の開始時から最大値の 90% (減衰の最大強度の少し後) の強度と一致させ、すべての強度減衰で同じ値を維持しながら IRF 干渉を最小限に抑えます。設定 相対時間ウィンドウ ラフトおよびスポットについては 25 ～ 50 ROI、ドロップについては 15 ～ 25 ROI を分析し、少なくとも 3 回の独立した実験から記録された 4 つ以上の反復から選択された画像を分析しました。両側 t 検定は、種間またはコアセルベート系間の統計的差異を評価するために使用されています。寿命 (τ) をピクセルごとに分析するために、各チャネルのフィールドにわたる寿命の合計減衰が計算され、2/3 成分の指数関数的減衰モデルの近似が実行されました。次に、各ピクセルの寿命減衰が、以前に計算された τ 値を使用してフィッティングされ、擬似カラー FLIM フィット画像が得られました。テール フィットの寿命範囲は同じチャネルのすべての画像で同じであり、各減衰で信頼性の高いフィットを提供するのに十分なフォトンが生成されました。FRET 分析では、11 フォトンのバックグラウンド信号 (FBG) を平均した 100 フォトンという低い強度しきい値を適用することでピクセルが選択されました。各チャネルの蛍光強度は、実験的に決定された補正係数によって補正されました:スペクトルクロストークαは0.004、直接励起βは0.0305、検出効率γは0.517でした。次に、ピクセル レベルでの FRET 効率が次の式を使用して計算されます。
ここで、FDD はドナー (緑) チャネルで観察される蛍光強度、FDA は間接励起下でアクセプター (赤) チャネルで観察される蛍光強度、FAA は直接励起下でアクセプター (赤) チャネルで観察される蛍光強度です (パイ）。蛍光強度パルスがチャネル内で観察されます。
25 μM 非標識単量体 Tau441 (25 μM αS の有無にかかわらず) を含む LLPS 反応溶液 100 μl を、接着剤ホイルコーティングを施した非結合 96 ウェルマイクロプレート上の LLPS バッファー (上記のように補足) に入れ、液滴形成を WF 顕微鏡でチェックしました。平衡。10分以内室温で 48 時間インキュベートした後、タンパク質ラフトおよびスポットの存在が確認されました。次に、ウェルからラフト上の液体を慎重に除去し、50μL の解離バッファー (10 mM HEPES、pH 7.4、1 M NaCl、1 mM DTT) を加え、10 分間インキュベートします。高い塩濃度により、残留PEGによるLLPSの繰り返しが確実に起こらず、静電相互作用のみで形成される可能性のあるタンパク質集合体が分解されます。次いでウェルの底をマイクロピペットチップで注意深くこすり取り、得られた溶液を空の観察ウェルに移した。サンプルを50μM ThTとともに1時間インキュベートした後、WF顕微鏡法によって単離されたスポットの存在をチェックした。pH 7.4、アジ化ナトリウム0.01％のPBS中の70μM αS溶液300μlを37℃および200rpmでオービタルシェーカー上で7日間インキュベートすることにより、超音波処理したαSフィブリルを準備します。次いで、溶液を9600×gで30分間遠心分離し、ペレットをPBS pH 7.4に再懸濁し、超音波処理した（Vibra-Cell VC130ソニケーター、Sonics、Newton、USAで1分間、50％サイクル、80％振幅）フィブリルサンプル小さなフィブリルのサイズ分布が比較的均一です。
FCS/FCCS 分析と 2 色同時計数検出 (TCCD) は、PIE モードを使用した FLIM-FRET 顕微鏡実験に使用したのと同じ MT200 時間分解蛍光共焦点顕微鏡 (Pico-Quant、ベルリン、ドイツ) で実行されました。これらの実験のレーザー出力は 6.0 μW (481 nm) と 6.2 μW (637 nm) に追加されました。これらのレーザー出力の組み合わせは、最適な計数率を達成し、光退色と飽和を回避しながら、使用する蛍光団のペアに同様の明るさを生み出すように選択されました。データ収集と分析は両方とも、市販の SymphoTime64 バージョン 2.3 ソフトウェア (PicoQuant、ベルリン、ドイツ) を使用して実行されました。
LLPS を使用して得られた単離された αS/Tau 凝集体のサンプルは、単離バッファーで適切な単分子濃度に希釈されます (コアセルベート サンプルから単離された時点で凝集体はすでに低濃度であるため、通常は 1:500 希釈)。サンプルは、1 mg/mL の濃度の BSA 溶液でプレコートされたカバースリップ (Corning, USA) に直接適用されました。
緑および赤チャネルの PIE-smFRET 分析では、25 光子の低い強度しきい値を適用して、モノマー イベントによって引き起こされる低強度シグナルをフィルターで除外しました (分離された凝集体と比較して、凝集サンプルの数よりもモノマーの数が多いことに注意してください)。この閾値は、分析用の凝集体を特に選択するために、純粋なモノマーサンプルの分析から得られたモノマーαS の平均強度の 5 倍として計算されました。PIE 駆動回路と TSCPC データ収集により、バックグラウンドとスペクトル クロストークの除去に役立つ生涯重み付けフィルターの適用が可能になりました。上記の閾値を使用して選択されたフレア強度は、バッファーのみのサンプルの発生対強度/ビンのヒストグラムから決定された平均バックグラウンド信号を使用して補正されました。大きな集合体に関連するバーストは、通常、時間トレース (1 ミリ秒に設定) 内の複数の連続したビンを占有します。このような場合、最大強度のビンが選択されました。FRET および化学量論分析では、理論的に決定されたガンマ因子 γ (0.517) が使用されました。スペクトルクロストークと直接励起の寄与は、使用される励起レーザー出力では無視できます (実験的に決定されます)。爆発における FRET の効率と化学量論は次のように計算されます。