ASTM A790 2507 / 2205 1.4462 / 1.4410 化学工業化学成分用二重溶接管、SPECC1L の欠乏は、スプライスされた関節の安定性の増加と頭蓋神経堤細胞の脱落の減少につながります。

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ASTM A790 2507/2205 1.4462/1.4410 化学工業のための二重溶接された管

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頭蓋神経堤細胞（CNCC）は、胎児の神経ひだから剥がれ落ち、咽頭弓に移動し、顔面中央構造の大部分を形成します。CNCC機能不全は、一般的な先天奇形である口腔顔面裂の病因において重要な役割を果たしています。ヘテロ接合性 SPECC1L 変異は、非定型および症候群性裂傷を有する患者で発見されています。今回我々は、培養SPECC1Lノックダウン細胞における標準接着結合（AJ）成分であるβ-カテニンとE-カドヘリンの染色が強化されたことを報告し、電子顕微鏡写真はAJの頂端-基底拡散を示している。頭蓋顔面形態形成におけるSPECC1Lの役割を理解するために、我々はSpecc1l欠損マウスモデルを作成した。ホモ接合変異体は胎児致死性であり、神経管閉鎖障害とCNCC積層化を示します。AJ タンパク質の染色は、変異型神経ひだで増加します。この AJ 欠陥は CNCC 剥離の欠陥と一致しており、AJ の溶解が必要です。さらに、Specc11 変異体は PI3K-AKT シグナル伝達を低下させ、アポトーシスを増加させます。インビトロでは、野生型細胞におけるPI3K-AKTシグナル伝達の軽度の阻害は、AJ変化を誘導するのに十分であった。重要なのは、SPECC1L ノックダウンによって誘発される AJ の変化は、PI3K-AKT 経路の活性化によって逆転できることです。総合すると、これらのデータは、SPECC1LがPI3K-AKTシグナル伝達およびAJ生物学の新規調節因子として、神経管閉鎖およびCNCC層別化に必要であることを示唆している。
頭蓋神経堤細胞（CNCC）は背側神経外胚葉に局在し、上皮間葉転換（EMT）を伴うプロセスを通じて発達中の神経ひだの神経上皮から剥離します1、2、3。遊走前上皮 CNCC は細胞間結合を破壊し、第 1 および第 2 咽頭弓を満たして頭蓋顔面軟骨の大部分を形成する遊走性間葉系 CNCC になります。したがって、CNCC機能を調節する遺伝子は、口腔顔面裂などの頭蓋顔面の先天異常の病因において破壊されることが多く、米国だけでも出生800人に1人が最も一般的に影響を受けている。先天奇形の一つ8．
CNCCの層間剥離は、マウスの胚発生の8.5日から9.5日の間の前神経管の閉鎖と同時に起こります。Irf69、10、Ghrl310、Cfl111、および Pdgfrα12 など、多数のマウス口腔顔面裂関連遺伝子の変異体も、ある種の神経管欠損を示します。しかし、Splotch 変異マウス (Pax3) は CNCC の重層化や遊走に影響を与えることなく神経管閉鎖の欠陥を示すため、神経管閉鎖と CNCC 重層化のプロセスは独立していると考えることができます 13,14。CNCCの切開と神経管の閉鎖に欠陥のある追加のマウスモデルは、これら2つのプロセスの共通の分子基盤を描写するのに役立ちます。
神経上皮細胞から CNCC を単離するには、接着結合 (AJ) の溶解が必要です。AJ は、アクチン フィラメントに結合した E-カドヘリン、β-カテニン、α-E-カテニン、α-アクチニンなどを含むタンパク質複合体で構成されています 2過剰発現研究 神経ひだにおける E-カドヘリンは、CNCC 剥離の減少または遅延を示しました。逆に、E-カドヘリンの抑制は早期の層別化をもたらします15、16。CNCCの層別化中にEMTを媒介する因子の多くは、転写因子（AP2α、Id2、FOXD3、SNAIL、TWIST、SOX10）およびマトリックスメタロプロテイナーゼ（MMP）などの細胞外マトリックス（ECM）リモデリングタンパク質ですが、CNCCは細胞骨格の直接的なAJ制御因子です。まだ知られていません。PI3K-AKT 経路は、主に癌研究から E-カドヘリン レベルに拮抗することが知られています 17。最近の研究では、マウスにおける PDGFα ベースの PI3K-AKT シグナル伝達の喪失が、口蓋裂や​​神経管欠損などの頭蓋顔面異常を引き起こすことが示されています 12。ただし、PI3K-AKT 経路と CNCC 層別化における AJ の安定性の関係は不明です。
我々は以前、斜裂（ObFC）またはテシエIV18裂として知られる、口から目に広がる重度の裂を有する2人の人々の最初の変異遺伝子としてSPECC1Lを同定した。SPECC1L 変異は、常染色体優性オピッツ G/BBB 症候群 (OMIM #145410) を患う 2 つの多世代家系で確認されており、この家系では罹患者が過距離と口唇口蓋裂を呈し 19、ティビ過距離症候群 (OMIM #145420) を有する 1 家系で確認されています20。 。オピッツ G/BBB 症候群の症例の半数以上は X 連鎖性 (OMIM #300000) であり、微小管関連細胞骨格のタンパク質 22 をコードする MID1 遺伝子の変異によって引き起こされます。我々は、微小管およびアクチン細胞骨格に関連するタンパク質でもあるSPECC1Lが、細胞接着および遊走中のアクチン細胞骨格のリモデリングに必要なシグナル伝達を媒介する可能性があると仮説を立てている 18 。in vitro および in vivo 研究を通じて、我々は PI3K-AKT シグナル伝達を介した AJ 安定性の新規調節因子として SPECC1L について説明します。細胞レベルでは、SPECC1L欠損により汎AKTタンパク質のレベルが低下し、AJの頂端-基底分散が増加したが、AKT経路の化学的活性化によって除去された。In vivo では、Specc11 欠損胚は神経管閉鎖障害と CNCC 解離の減少を示します。したがって、SPECC1L は、顔の形態形成中の正常な CNCC 機能に必要な、高度に制御された細胞接着ベースのシグナル伝達において機能します。
細胞レベルでのSPECC1Lの役割を特徴付けるために、我々は、SPECC1L18を欠損している以前に記載された安定な骨肉腫細胞株U2OSを使用した。SPECC1L (kd) ノックダウンを有するこれらの安定した U2OS 細胞では、SPECC1L 転写物およびタンパク質のレベルが中程度 (60 ～ 70%) 減少し、アクチン細胞骨格の移動および再構成に欠陥がありました 18。 SPECC1L は有糸分裂異常を引き起こすことが示されています 23 。さらに特徴付けを行った結果、安定した SPECC1L-kd 細胞は非常に高いコンフルエンス度で形態が変化することがわかりました (図 1)。個々のコントロール細胞と低コンフルエンスでの kd 細胞は同様に見えました (図 1A、D)。融合から 24 時間後、コントロール細胞は立方体の形状を保持しましたが (図 1B、E)、SPECC1L-kd 細胞は伸長しました (図 1C、F)。この細胞形状の変化の程度は、コントロール細胞と kd 細胞の in vivo ライブイメージングによって捕捉されました (動画 1)。コンフルエントな細胞における SPECC1L の役割を決定するために、我々はまずその発現を調べました。融合により SPECC1L タンパク質レベルが増加するのに対し (図 1G)、SPECC1L 転写レベルは増加しないことがわかりました (図 1H)。さらに、細胞密度が増加するにつれて、SPECC1Lタンパク質は細胞間境界に蓄積し（図2A〜E）、そのパターンは膜結合β-カテニンのパターンと重複しました（図2A'〜E'）。SPECC1L とアクチン細胞骨格との関連を考慮して、我々は SPECC1L がアクチンベースの接着結合 (AJ) と相互作用すると仮説を立てました 18,23 。
(AF) SPECC1L ノックダウン (DF) 細胞は、コントロール U2OS 細胞 (AC) と比較して、高コンフルエンスで伸長します (F)。ここに示すのは、異なる細胞密度に対して選択した 6 つの時点 (T1、T3、T6) のうちの 3 つです。(G) SPECC1L タンパク質が、対照細胞の低コンフルエンスと比較して、高コンフルエントで安定化されていることを示すウェスタンブロット分析。SPECC1L のウェスタンブロットでは、予想される 120 kDa のバンドと、おそらく翻訳後修飾された、より高い分子量のバンドが示されています (*)。ウェスタンブロット分析は、低コンフルエンスと高コンフルエンスについて同じ条件下で実行されました。低コンフルエンスおよび高コンフルエントの SPECC1L を示す画像は、同じブロットから取得されました。同じブロットを除去し、β-アクチン抗体で再検査しました。(H) 定量的 RT-PCR 分析では、SPECC1L 転写レベルに有意な変化は示されませんでした。エラーバーは、4 つの独立した実験からの SEM を表します。
(AE) SPECC1L ノックダウン (kd) を有する U2OS 細胞における細胞形状分析と AJ 変化を正規化するために、細胞密度の範囲を表す 6 つの時点 (T1 ～ T6) を選択しました。これらの時点のうち最初の 5 つの時点には、単一細胞 (T1)、小細胞クラスターの 50 ～ 70% 融合 (T2)、kd 細胞の再形成を伴わない融合 (T3)、kd 細胞の再形成 (T4)、および 24 時間の変化が含まれます。kd (T5) 細胞の後部型。SPECC1L タンパク質は、T1 では主に細胞質内に分散していました (A) が、その後の時点では細胞間境界でその蓄積が観察されました (B ～ E、矢印)。(FJ) β-カテニンは、AJ 複合体に関連する細胞間境界で同様の蓄積を示します。(A'-E') SPECC1L と β-カテニンは、高い細胞密度で細胞境界で重複した染色を示します (矢印)。(F'-J') SPECC1L-kd 細胞では、β-カテニン染色は低細胞密度では正常に見えますが (F'-H')、細胞の形状が変化するにつれて拡大します (I'、J'; 矢印)。これは、AJ であることを示しています。変更されました。バー = 10 μm。
次に、SPECC1L 欠損が AJ に及ぼす影響を調べようとしました。我々は、標準成分である F-アクチン、ミオシン IIb、β-カテニン、E-カドヘリンなどのいくつかの AJ 関連マーカーを使用しました 24、25、26、27。以前に記載されているように、アクチンストレスファイバーはSPECC1L-kd細胞で増加しました（図3A、B） 18 。アクチンフィラメントに結合したミオシン IIb は、in vitro で SPECC1L-kd 細胞において同様の増加を示しました (図 3C、D)。AJ関連β-カテニンは細胞膜でカドヘリンに結合し、対照立方体細胞では正常な「ハニカム」発現パターンを示します（図3E、G）。興味深いことに、共焦点顕微鏡を使用した平面画像では、コンフルエントな SPECC1L 欠損細胞の細胞膜上の β-カテニン (図 3E、F) および E-カドヘリン (図 3G、H) の染色は、拡張された染色の顕著なパターンを示しました。kd細胞におけるAJ関連β-カテニン染色のこの拡大は、コンフルエントで最も顕著であったが、細胞形状の変化に先行しているようであった（図2F-J、F'-J'）。この拡張された AJ 染色の物理的性質を決定するために、透過型電子顕微鏡 (TEM) によって SPECC1L-kd U2OS 細胞の頂端 - 基底表面の細胞境界を調べました (図 3I、J)。AJを示す個別の電子密度領域（矢印）を有する対照細胞（図3I）とは対照的に、kd細胞（図3J）は、頂基底面に沿ってAJを示す高電子密度の大きく連続した領域を示した。。さらに、横断面では、kd細胞の広範な細胞膜の折り畳みが観察されました（図S1A、B）。これは、β-カテニンおよびE-カドヘリンの染色バンドの拡張パターンを説明しています（図3F、H）。AJにおけるSPECC1Lの役割を裏付けるために、コンフルエントなU2OS細胞の溶解物中でβ-カテニンがSPECC1Lと共免疫沈降した（図3K）。AJ マーカーの拡張免疫染色と併せて、TEM 分析は、SPECC1L 欠損により AJ の頂端基底密度と分散が増加するという我々の仮説と一致しました。
(AH) 融合後 48 時間の kd 細胞における F-アクチン染色の増加 (T6; A、B)。F-アクチンに関連するミオシン IIb の染色の変化 (C、D)。対照細胞(E、G)におけるβ-カテニンおよびE-カドヘリン膜染色の滑らかなパターンは、SPECC1L-kd(F、H)細胞において増強された。バー = 10 μm。(I – J) 頂端と基底の細胞間接合を観察した電子顕微鏡写真。対照細胞は、粘着結合を示す明確な電子密度の高い領域を示します (I、矢印)。対照的に、SPECC1L-kd 細胞の頂端 - 基底接合部全体は電子密度が高いように見え (J、矢印)、接着接合部の密度の増加と分散を示しています。(K) β-カテニンは、コンフルエントな U2OS 細胞溶解物中で SPECC1L と免疫共沈降されました。4 つの独立した実験のうちの 1 つを表す 1 つのスポットから撮影された画像。
頭蓋顔面形態形成におけるSPECC1Lの役割を理解するために、我々は、イントロン1を表す2つの独立したESトラップ細胞株DTM096およびRRH048（カリフォルニア州ベイゲノミクス）を使用してSpecc1l欠損マウスモデルを作成し、Specc1l転写物は15で捕捉された（図1）。 。４Ａ、図Ｓ２）。デコイベクターインサートのゲノム位置は、全ゲノム配列決定によって決定され、PCRによって確認されました（図S2）。どちらの遺伝子トラップ設計でも、捕捉時に Specc11-lacZ レポーターのインフレーム融合が可能でした。したがって、X-gal 染色によって測定された lacZ 発現を Specc11 発現の指標として使用しました。両方の対立遺伝子は同様の lacZ 発現パターンを示し、イントロン 1 の DTM096 遺伝子トラップはイントロン 15 の RRH048 よりも強い発現を示しました (図示せず)。ただし、Specc1l は広く発現しており、E8.5 の神経ひだ (図 4B)、E9.5 および E10.5 の神経管および顔面突起 (図 4C、D)、および発達中の四肢で特に強く発現しています。 E10で。5 と目 (図 4D)。我々は以前、E10.5の最初の咽頭弓におけるSPECC1L発現が上皮とその下にある間葉に存在し18、CNCC系統と一致していることを報告した。CNCC における SPECC1L 発現をテストするために、E8.5 神経ひだ (図 4E ～ J) および E9.5 頭蓋骨切片 (図 4K ～) を実行しました。E8.5では、SPECC1Lは、NCCマーカーで染色された細胞(図4G、J)を含む神経ひだを強く染色した(図4E、H)。E9.5では、SPECC1L（図4K、N）はAP2A（図4L、M）またはSOX10（図4O、P）と共染色された移動性CNCCを強く染色した。
(A) ES DTM096 (イントロン 1) および RRH048 (イントロン 15) 細胞クローンへのデコイベクター挿入を示すマウス Specc11 遺伝子の概略図。(BD) E8.5 から E10.5 までの Specc11 発現を表すヘテロ接合性 Specc11DTM096 胚の lacZ 染色。NE = 神経外胚葉、NF = 神経ひだ、PA1 = 第一咽頭弓。(EP) E8.5 (NF; EJ) 神経ひだおよび E9.5 (KP) 頭蓋骨切片における NCC マーカー AP2A および SOX10 を用いた SPECC1L 免疫染色。SPECC1L 染色は、AP2A (F、G; 矢印) および SOX10 (I、J; 矢印) で標識された細胞を含む神経ひだ E8.5 (E、H; 矢印) で広く観察されました。E9.5では、SPECC1Lは、AP2A(L、M;矢印)およびSOX10(O、P;矢印)で標識された移動性CNCC(K、N;矢印)を強く染色した。
ヘテロ接合性 Specc1lDTM096/+ マウスと Specc1lRRH048/+ マウスの間の交雑は、2 つのジーントラップ対立遺伝子が相補的ではなく、いずれかのジーントラップ対立遺伝子の複合ヘテロ接合体と胎児ホモ接合体が胎児致死性であることを示しています (表 S1)。メンデル比は、出生時のヘテロ接合体の生存率の低下を示しました (予想 1.34 対 2.0)。ヘテロ接合体では周産期死亡率が低く、頭蓋顔面異常を有する個体もいることに注目しました（図S3）。しかし、これらの周産期頭蓋顔面表現型の浸透度が低いため、その根底にある病態生理学的メカニズムを研究することが困難になります。したがって、我々はホモ接合型 Specc11 変異体の胎児致死表現型に焦点を当てました。
ほとんどの複合ヘテロ接合性またはホモ接合性 Specc1lDTM096/RRH048 変異体胚は E9.5 ～ 10.5 以降は発生せず (図 5A ～ D)、神経管は前方で閉じず (図 5B、D)、場合によっては後方で閉じた (図示せず)。 。。この頭蓋神経管閉鎖欠損は、E10.5 で神経ひだに残っている DLX2 とマークされた CNCC の大部分と関連しており、解離がないことを示しています (図 5A' ～ D')。CNCC の全体的なサイズも減少したかどうかを確認するために、Wnt1-Cre および ROSAmTmG を使用してジーン トラップ ライン内の CNCC ラインに GFP のタグを付けました。全胚から選別された GFP+ NCC および GFP- (RFP+) 非 NCC をストリーミングします。E9.5では、フローソートされたGFP標識CNCCの割合は、WT胚と変異胚の間で有意に変化せず(図示せず)、正常なCNCC仕様を示している。したがって、我々は、露出した神経ひだに残留する Wnt1-Cre および DLX2 染色 (図 5B') は、おそらく SPECC1L-kd 細胞で見られるように、AJ 細胞の密度または分散の増加による CNCC 層形成の欠陥によるものであると仮説を立てました。NCC マーカー SOX10、AP2A、および DLX2 を使用して、神経ひだ内の CNCC の存在を確認しました (図 5E ～ R)。E8.5では、3つのNCCマーカーすべてに対する神経襞染色が、WT(図5E、G、I)およびSpecc11変異体(図5F、H、J)の切片で観察された。E9.5では、NCCマーカーはWT切片の移動中のNCCを染色しましたが（図5M、O、Q）、残留NCC染色はSpecc1l変異体胚の露出した神経ひだで観察されました（図5N、P、R）。SOX10 と DLX2 は遊走中の CNCC をマークするため、この結果は、SPECC1L 欠損 CNCC は遊走後の仕様を達成するが、神経ひだから遊走できないことを示唆しています。
Specc11欠損は、神経管閉鎖不全、頭蓋神経堤細胞およびAJの剥離を引き起こします。
(A、B') E9.5 WT (A) Wnt1-Cre で標識された遊走頭蓋神経堤細胞 (CNCC) を保持する胚 (A')。対照的に、Specc11 変異体胚は、開いた神経ひだ (B)、矢印) および移動していない CNCC (B'、矢印) を示します。（C、D'）E10.5 WT胚（C、C'）およびSpecc11（D、D'）のCNCCマーカーDLX2の明視野画像（C、D'）および免疫染色（C'、D'）。WT E10.5 胚では、DLX2 陽性 CNCC が鰓弓 (C'、矢印) に定着しますが、変異体では、開いた神経ひだ (D'、矢印) および最初の咽頭弓 (D'、矢印) に顕著な染色が残ります。矢印）。）若干の染色（矢印）を伴うが、ＣＮＣＣの層間剥離および移動が不十分であることを示している。ER) E8.5 (E-L) および E9.5 (M-R) 段階の WT および Specc1l 変異胚の切片を NCC マーカー SOX10 (E、F、M、N)、AP2A (G、H、 O、P ) および DLX2 (I、J、Q、R)。E8.5では、野生型神経襞(NF)および変異体切片でNCC染色が観察された。E8.5 WT (K) および変異体 (L) における SOX10 と β-カテニンの共染色により、神経ひだの細胞境界での β-カテニン染色の増加が明らかになりました。E9.5では、移動するCNCC（M、O、Q）の野生型染色が観察されましたが、変異体では、重層化されていないCNCCは開いた神経ひだ（N、P、R）を染色しました。(S – Z) E9.5 変異を持つ WT および Specc11DTM096/RRH048 胚の冠状切片における in vivo AJ 標識分析。おおよその断面図を右上隅に示します。変異体組織の切片では、F-アクチン (S、T) およびミオシン IIb (U、V) の染色の増加が観察されました。図 3 の in vitro の結果と同様に、変異胚では、β-カテニン (W、X) および E-カドヘリン (Y、Z) の膜染色の増強が観察されました。(AA-BB) 頂端細胞と基底細胞の境界を越えた野生型胚の切片の電子顕微鏡写真は、接着結合を示す明確な電子密度の高い領域を示しています (AA、矢印)。対照的に、Specc11 変異体胚の切片 (BB、矢印) では、頂基底接合部全体が電子密度が高く、接着接合部の密度の増加と分散が示されています。
層形成の減少が AJ の変化によるものであるという仮説を検証するために、Specc1l 変異体胚の露出した神経ひだにおける AJ 標識を調べました (図 5S ～ Z)。アクチンストレスファイバーの増加（図5S、T）と、それに付随してアクチンファイバー上のミオシンIIB染色の局在化の増加（図5U、V）が観察されました。重要なことに、細胞間境界でのβ-カテニン (図5W、X) およびE-カドヘリン (図5Y、Z) の染色の増加が観察されました。また、E8.5胚の神経ひだにおけるNCCのβ-カテニン染色も調べました（図5K、L）。β-カテニン染色は、Specc1l変異体神経襞においてより強いようであり(図5LおよびK)、AJ変化が始まったことを示唆している。E9.5胚の頭蓋骨切片の電子顕微鏡写真では、WTと比較してSpecc1l変異体胚における拡散電子密度染色の増加が再び観察されました（図5AA、BBおよびS1E-H）。総合すると、これらの結果は、SPECC1L-kd U2OS 細胞における我々の in vitro 結果を支持し、我々の変異体胚では異常な AJ 染色が CNCC 層別化に先行することを示唆しています。
AKT 活性と E-カドヘリン安定性の間の既知の拮抗関係を考慮して、我々は PI3K-AKT シグナル伝達の関与を仮説を立てました。さらに、E9.5〜10.5で致死性（<5％）を回避し、代わりにE13.5付近で定着した変異体胚の一部で表皮下の水疱を観察しました（図S3）。表皮下小胞は、PDGFRα12 に基づく PI3K-AKT シグナル伝達の低下の特徴です。ファンタウッツォら。(2014) は、PdgfraPI3K/PI3K 変異胚における PDGFRα ベースの PI3K 活性化の破壊により、表皮下小胞、神経管欠損、および口蓋裂の表現型が生じることを報告しました。実際、汎ＡＫＴおよび活性リン酸化Ｓｅｒ４７３－ＡＫＴのレベルは、Ｓｐｅｃｃ１１変異体組織においてインビボでＥ９．５胚停止まで低下した（図６Ａ～Ｄ）。リン酸化Ser473-AKTのレベルの減少は、完全に、インビボ(図6E)およびインビトロ(図6F)における汎AKTのレベルの減少によるものである可能性がある。in vitro での減少は、U2OS 細胞が細胞の形状と AJ 密度の変化を伴って高度にコンフルエントになった場合にのみ観察されました (図 6D)。したがって、我々のデータは、SPECC1Lが頭蓋顔面の形態形成におけるPI3K-AKTシグナル伝達の新規な正の調節因子であることを示唆している。
(A-E) Specc1l 変異体胚からの E8.5 (A、B) および E9.5 (C、D) 頭蓋骨切片または E9.5 ライセート (E) 活性リン酸化 S473-AKT および汎 AKT タンパク質の減少レベルを示す、対照WTと比較。ウェスタンブロッティングは、同じ条件下で野生型ライセートと変異型ライセートに対して実行されました。SPECC1L について示されている画像は、1 つのブロットから取得したものです。同じブロットを除去し、抗汎ACT抗体およびβアクチン抗体を用いて再検査した。E8.5 神経ひだ (A、B) の汎 AKT レベルと E9.5 頭蓋骨切片のリン酸化 S473-AKT レベルは大幅に減少しました。(F) Pan-AKT レベルは、高コンフルエンスで採取された SPECC1L-kd U2OS 細胞の溶解物でも同様に減少しました。エラーバーは、3 つの独立したウェスタンブロット定量からの SEM を表します。(GJ) KI67 および切断されたカスパーゼ 3 でそれぞれ染色された E9.5 の WT 胚の切片。細胞増殖 (G、G') およびわずかなアポトーシス活性 (H、H') を示します。Specc11 変異体胚は同等の細胞増殖を示します (I) が、アポトーシスを起こしている細胞の数は大幅に増加しています (J)。
次に、増殖とアポトーシスのマーカーを調べました。E9.5胚の増殖には差は観察されず（図6E、GとI）、KI67染色で測定した増殖指数はWT変異体で82.5％、Specc1l変異体で86.5％でした（p<0.56、Fisher's）正確なテスト）。同様に、E8.5の神経襞における切断型カスパーゼ3の染色によって測定されたアポトーシスの差異は、胚停止まで観察されませんでした（図示せず）（図示せず）。対照的に、アポトーシスはすべての E9.5 変異体胚で有意に増加しました (図 6F、H および J)。この全体的なアポトーシスの増加は、PI3K-AKT シグナル伝達の減少と初期胚致死率と一致しています 29、30、31。
次に、kd 細胞における AJ 変化における PI3K-AKT シグナル伝達の因果的役割を確認するために、対照細胞と kd 細胞の経路を化学的に変更しました (図 7A ～ F)。我々は、コンフルエントなSPECC1L-kd細胞で観察された細胞形状変化表現型をマーカーとして使用し、最長寸法(長さ)と対応する垂直寸法(幅)の比を使用して定量化した。比較的円形または立方体のセルでは、比率 1 が予想されます (図 7G)。細胞の形状に加えて、β-カテニン染色によるAJへの影響も確認しました（図7A'〜F'）。ウォルトマニンを使用したPI3K-AKT経路の阻害は、対照細胞(図7A、C)およびAJ(図7A')の細胞形状を変化させるのに十分であった。PI3K-AKT活性化因子SC-79は、対照細胞における細胞形状(図7A、E)またはAJ拡大(図7A')に影響を与えなかった。SPECC1L-kd 細胞では、PI3K-AKT 経路をさらに抑制すると、アポトーシスが増加し (図 7B、D)、β-カテニン染色が顕著に増加しました (図 7B')。これは、我々の in vivo 重変異体と一致しています。重要なことに、PI3K-AKT経路の活性化により、細胞の形状(図7B、F)とAJ表現型(図7B)が大幅に改善されました。細胞形状の変化を細胞真円度比（CCR）として定量化し、上記のように有意性について比較した（図7G）。実際、対照細胞（図 7G、CCR = 1.56）では、ワートマニン処理は、観察されたものと同様の程度まで細胞の形状を有意に変化させるのに十分でした（図 7G、CCR = 3.61、p < 2.4 × 10-9）。 SPECC1Lで。-kd 細胞 (図 7G、CCR = 3.46)。SPECC1L-kd 細胞のワートマニン処理 (図 7G、CCR = 3.60、無視できる) は、未処理の kd 細胞 (図 7G、CCR = 3.46、無視できる) またはワートマニン処理した対照細胞 (図 7G) よりも有意ではありませんでした。、CCR = 3.46、無視できるほど）さらに細胞の伸長に影響します（7G、CCR = 3.61、無視できる）。最も重要なことは、SC-79 AKT アクチベーターが SPECC1L-kd 細胞の伸長した表現型を回復したことです (図 7G、CCR = 1.74、p < 6.2 × 10-12)。これらの結果は、SPECC1LがPI3K-AKTシグナル伝達を調節していることを確認し、SPECC1Lの中程度の減少は細胞接着に影響を与え、一方、強い減少はアポトーシスを引き起こすことを示唆している(図8)。
(A–F') PI3K-AKT 経路阻害剤ウォルトマニン (C、D) または SC-79 活性化剤 (E、F) で処理したコントロール (A、C、E) および SPECC1L-kd 細胞 (B、D、F) 細胞未処理の対照細胞は立方体であり (A)、β-cat 細胞染色は正常 (A') ですが、kd 細胞は伸長しており (B)、β-cat 染色が増加しています (B')。PI3K-AKT 経路の抑制後、コントロール細胞は β-cat の拡大 (C') とともに伸長しました (C)。一方、kd 細胞はアポトーシスを起こし始めました (D)。これは高度に変異した胚と同様であり、β-cat の極度に増強されたことを示しました。染色(D')。PI3K-AKT 経路の活性化後、コントロール細胞は立方体状を維持し (E)、β-cat (E') 染色は正常でしたが、kd 細胞は細胞形状 (F) と β-cat (F') 染色が大幅に改善されました。 (G) (AF) における細胞形状変化の程度は、MetaMorph ソフトウェアを使用して最長寸法 (長さ) と対応する垂直寸法 (幅) の細胞真円度比 (CCR) を使用して定量化されました。未処理 (NT) SPECC1L-kd 細胞 (CCR = 3.46) は、対照細胞 (CCR = 1.56、p < 6.1 × 10–13) よりも有意に長かった。対照細胞におけるPI3K-AKT経路のワートによる阻害は、細胞形状に同様の伸長を引き起こすのに十分であった(CCR=3.61、p<2.4×10-9)。同様に、SPECC1L-kd 細胞における SC-79 による AKT 活性化により、細胞伸長が対照レベルまで回復しました (CCR = 1.74、p < 6.2 × 10-12)。SPECC1L-kd細胞のウォルトマニン処理により、アポトーシスが増加しましたが、未処理のkd細胞（CCR=3.46、ns）またはウォルトマニン処理対照細胞（3.61）と比較して、細胞形状変化（CCR=3.60）は増加しませんでした。ns = 関係ありません。50 個のセルの +/- SEM 測定が表示されます。統計的差異は、スチューデントの t 検定を使用して計算されました。
(A) それぞれ AJ 変化とレスキューを引き起こす PI3K-AKT 経路の阻害と活性化の概略図。(B) SPECC1L による AKT タンパク質安定化の提案されたモデル。
遊走前の CNCC は、前部神経襞神経上皮細胞から分離するために AJ 溶解を必要とします 1,15,32。in vitro と in vivo の両方で SPECC1L 欠損細胞における AJ 成分の染色の増加と頂端と基底の AJ 非対称分布の喪失は、SPECC1L が β-カテニンに物理的に近接していることと相まって、SPECC1L が AJ の局所安定性を適切に維持するように機能していることを示唆しています。組織の筋肉。アクチン細胞骨格。SPECC1L とアクチン細胞骨格および β-カテニンとの関連、および SPECC1L の非存在下での凝縮アクチンフィラメント数の増加は、観察された AJ 密度の増加と一致しています。別の可能性は、SPECC1L 欠損細胞におけるアクチン線維の数の増加が細胞間張力の変化を引き起こすということです。細胞ストレスは AJ 33 の動態に影響を与えるため、電圧の変化により AJ 34 がさらに拡散する可能性があります。したがって、変更は CNCC レイヤーに影響します。
Wnt1 は、神経堤細胞を生じさせる初期の神経ひだで発現されます。したがって、Wnt1-cre 系統追跡は、NCC35 の移動前と移動中の両方をマークします。しかし、Wnt1 は同様に初期神経襞に由来する背側脳組織クローンもマークするため 35,36 、開いた神経襞における Wnt1 マーカーに対する E9.5 変異体の染色は CNCC ではない可能性があります。NCC マーカー AP2A および SOX10 の陽性染色により、Specc11 変異体胚の露出した神経ひだには確かに CNCC が含まれていることが確認されました。さらに、AP2A および SOX10 は初期遊走 NCC のマーカーであるため、陽性染色はこれらの細胞が E9.5 によって層別化できない遊走後の CNCC であることを示しました。
我々のデータは、SPECC1LによるAJの分子制御がPI3K-AKTシグナル伝達によって媒介されることを示唆している。SPECC1L 欠損細胞および組織では、AKT シグナル伝達が減少します。Fantauzzo らによる調査結果。頭蓋顔面の形態形成におけるPI3K-AKTシグナル伝達の直接的な役割を支持している。(2014) は、PDGFRα ベースの PI3K-AKT シグナル伝達の活性化の欠如が口蓋裂表現型を引き起こすことを示しました。また、PI3K-AKT 経路の阻害が、U2OS 細胞の AJ と細胞形状を変化させるのに十分であることも示します。私たちの発見と一致して、Cain et al。図３７は、内皮細胞におけるＰＩ３Ｋ α１１０サブユニットの下方制御が、「接続性指数」の増加と呼ばれる、細胞周囲のβ－カテニン染色の同様の増加をもたらすことを示した。しかし、アクチンフィラメントが既に高度に組織化されている内皮細胞では、PI3K-AKT経路が抑制されると細胞の形状が緩んでしまいます。対照的に、SPECC1L-kd U2OS 細胞は細長い細胞形状を示しました。この違いは細胞の種類に特有のものである可能性があります。PI3K-AKT シグナル伝達の抑制はアクチン細胞骨格に永続的に影響を及ぼしますが、細胞の形状に対する影響は、中心アクチン線維の密度と組織の変化によって引き起こされる張力の変化によって決まります。U2OS細胞では、SPECC1L欠損AJの変化と回復のマーカーとして細胞形状の変化のみを使用しました。結論として、SPECC1L欠損症におけるAKT経路の阻害によりAJの安定性が向上し、CNCCにおける層間剥離が減少すると仮説を立てています。
興味深いことに、SPECC1L の非存在下では、リン酸化 473-AKT レベルに加えて、in vitro および in vivo で汎 AKT レベルも低下しており、AKT タンパク質の安定性またはターンオーバーのレベルで PI3K-AKT シグナル伝達が調節されていることを示唆しています。SPECC1L および MID1 遺伝子は、どちらも Opitz/GBBB 症候群に関連しており、微小管を安定化するタンパク質をコードしています 18,22 。SPECC1L と MID1 が微小管の安定化を仲介するメカニズムは完全には理解されていません。SPECC1L の場合、この安定化には微小管のサブセットのアセチル化の強化が含まれます 18 。SPECC1L が同様のメカニズムを使用して、AKT などの他のタンパク質を安定化している可能性があります。AKT タンパク質のリジン残基のアセチル化により、膜局在化とリン酸化が減少することが示されています 38。さらに、AKT 上の同じリジン残基での K63 鎖のユビキチン化は、その膜局在化と活性化に必要です 39,40。さまざまなハイスループット酵母ツーハイブリッドスクリーニングで同定された SPECC1L タンパク質と相互作用するいくつかの因子のうち、CCDC841、ECM2942、APC、および UBE2I43 の 4 つが、ユビキチン化または SUMO 化を介してタンパク質の代謝回転または安定性に関与していると考えられています。SPECC1L は AKT リジン残基の翻訳後修飾に関与し、AKT の安定性に影響を与える可能性があります。ただし、AKT タンパク質の局在化と安定性における SPECC1L の重要な役割はまだ解明されていません。
in vivo での SPECC1L 発現の重度の欠陥は、AJ マーカー染色の増加と CNCC オーバーレイの欠陥、さらにはアポトーシスと初期胚致死率の増加をもたらしました。これまでの報告では、アポトーシスのレベルが増加したマウス変異体が神経管欠損 44、45、46、47 および頭蓋顔面欠損 48 に関連していることが示されています。神経ひだまたは咽頭弓における過剰な細胞死は、適切な形態形成運動に必要な細胞数の不足をもたらす可能性があることが示唆されている 48、49、50。対照的に、SPECC1L発現が中程度に低下したSPECC1L欠損細胞株は、細胞死の増加の証拠がなく、AJ変化のみを示しました。しかし、これらの Kd 細胞における PI3K-AKT 経路の化学的阻害は、アポトーシスの増加をもたらしました。したがって、SPECC1L の発現または機能が適度に低下すると、細胞の生存が確保されます。これは、st での逮捕を逃れる稀な Specc11 変異胚であるという観察と一致しています。E9.5は、おそらく遺伝子捕捉効率の低下により、神経管を閉じて発達の後半で停止することができ、多くの場合頭蓋顔面欠陥を伴います（図S3）。また、これと一致するのは、頭蓋顔面異常を伴うヘテロ接合型 Specc1l 胚がまれに発生すること（おそらく遺伝子捕捉効率の向上によるもの）、および 2 つの SPECC1L オルソログ（specc1lb）のうちの 1 つ（specc1lb）が、胚の欠失を含む後期胚表現型を引き起こすというゼブラフィッシュでの発見である。下顎と両側裂51．したがって、ヒト患者で同定されたヘテロ接合型SPECC1L機能喪失変異は、頭蓋顔面形態形成中にSPECC1L機能に小さな障害を引き起こす可能性があり、これは口腔顔面裂を説明するのに十分である。SPECC1L に基づく細胞間接触の制御は、口蓋形成と咽頭弓の融合にも役割を果たしている可能性があります。SPECC1L 機能のさらなる研究は、神経上皮細胞の運動性と頭蓋顔面の形態形成における神経管閉鎖中の CNCC における一時的な細胞間接触の役割を解明するのに役立ちます。
U2OS骨肉腫対照細胞およびSPECC1L-kd細胞は以前に記載されている(Saadi et al., 2011)。SPECC1L に対する抗体も以前に特徴付けられています (Saadi et al., 2011)。抗β-カテニン抗体 (ウサギ; 1:1000; Santa Cruz, Dallas, TX) (マウス; 1:1000; Cell Signaling Technology, Danvers, MA)、ミオシン IIb (1:1000; Sigma-Aldrich, St. Louis) ) 、MO) )、E-カドヘリン (1:1000; Abkam、マサチューセッツ州ケンブリッジ)、AP2A (1:1000; Novus Biologicals、コロラド州リトルトン)、SOX10 (1:1000; 1000; Aviva Systems Biology、サンディエゴ) 、カリフォルニア州）、DLX2（1:1000; Abcam、マサチューセッツ州ケンブリッジ）、ホスホ-Ser473-AKT（1:1000; Cell Signaling Technology、マサチューセッツ州ダンバース）、pan-AKT（1:1000; ThermoFisher Scientific、マサチューセッツ州ウォルサム） ）、KI67（1:1000; Cell Signaling Technology、マサチューセッツ州ダンバーズ）、切断カスパーゼ 3（1:1000; Cell Signaling Technology、マサチューセッツ州ダンバーズ）およびβ-アクチン（1:2500; Sigma-Aldrich、セントルイス、 MO ) を記載どおりに使用しました。。アクチンフィラメントは、Acti-stain ローダミンファロイジン (Cytoskeleton、コロラド州デンバー) で染色されました。
U2OS対照細胞およびSPECC1L-kd細胞は、10％ウシ胎児血清を補充した標準的な高グルコースDMEM（Life Technologies、カリフォルニア州カールズバッド）中で培養した。AJ 変化については、2 x 105 個の細胞を 0.1% ブタゼラチン (Sigma-Aldrich、セントルイス、ミズーリ州) で処理したガラス上に播種し、細胞形状の変化を観察しました。細胞は、示された異なる時点で収集されました:播種後 4 時間 (t = 1)、播種後 24 時間 (t = 2)、細胞形状の変化なしのコンフルエント (t = 3)、細胞形状の変化 (t = 4) 、細胞形状変化から 24 時間後 (t = 5)、細胞形状変化から 48 時間後 (t = 6) (図 1、2、3)。PI3K-AKT経路を調節するために、細胞をPI3K-AKT阻害剤ワートマニン（TOCRIS Biosciences、ミネソタ州ミネアポリス）またはSC-79活性化剤（TOCRIS Biosciences、ミネソタ州ミネアポリスアダムス）とともに指定の濃度で培養しました。化学物質を含む培地は毎日交換した。
通常の培養条件下で生コントロール細胞と KD 細胞についてフレームごとの記録を行い、位相差画像を 7 日間 10 分ごとに収集しました。画像は、機械ステージと QImaging Retiga-SRV カメラに接続された 10 × N-PLAN 対物レンズを備えたコンピューター制御の Leica DM IRB 倒立顕微鏡を使用して取得されました。イメージング中、細胞培養は 5% CO2 の湿潤雰囲気下で 37°C に維持されました。
Regional Mutant Mouse Resource Center (UC Davis, CA) の 2 つの遺伝子トラップ ES 細胞株 DTM096 および RRH048 を使用して、Specc1lgtDTM096 および Specc1lgtRRH046 と名付けられた Specc11 欠損マウス株を作製しました。簡単に説明すると、129/REJ ES 細胞を C57BL6 胚盤胞に注入しました。得られたキメラ雄マウスを雌のC57BL6マウスと交配させて、アグーチ毛色の子孫を同定した。遺伝子トラップベクターインサートの存在は、ヘテロ接合体を識別するために使用されました。マウスは 129/REJ;C57BL6 の混合バックグラウンドで飼育されました。遺伝子トラップベクターの挿入部位の位置は、RT-PCR、ゲノム配列決定、および遺伝子相補によって確認されました（補足図1）。ダブルヘテロ接合性 Specc1lGT マウスの CNCC 系統を追跡するために、ROSAmTmG (#007576) と Wnt1-Cre (#003829) マウス (Jackson Laboratory、メイン州バーハーバー) を交配して、Specc1l 変異体胚に ROSAmTmG および Wnt1-Cre 対立遺伝子を生成させました。マウスにおけるすべての実験は、カンザス大学医療センターの施設内動物管理使用委員会によって承認されたプロトコールに従って実行されました。
胚を室温で 60 分間 (1% ホルムアルデヒド、0.2% グルタルアルデヒド、2 mM MgCl2、0.02% NP-40、5 mM EGTA) 中で固定しました。X-gal 染色液 (5 mM フェリシアン化カリウム、5 mM フェロシアン化カリウム、2 mM MgCl2、0.01% デオキシコール酸ナトリウム、0.02% NP-40、1 mg/ml X-gal) で固定後、37°C​​ で染色現像を実行しました。 。1 ～ 6 時間以内に °C に戻ります。胚を 4% PFA で後固定し、視覚化しました。
ウェスタンブロッティングでは、細胞を、HALTプロテアーゼ阻害剤（Sigma-Aldrich、セントルイス、ミズーリ州）の混合物を補充した受動溶解緩衝液（Promega、フィッチバーグ、ウィスコンシン州）中で溶解させた。ライセートを 12% ポリアクリルアミド Mini-PROTEAN TGX 既製ゲル (Bio-Rad、カリフォルニア州ハーキュリーズ) で処理し、Immobileon PVDF 膜 (EMD Millipore、マサチューセッツ州ビレリカ) に転写しました。膜は、０．１％ Ｔｗｅｅｎを含むＰＢＳ中の５％ミルク中でブロックされた。抗体を4℃で一晩、または室温で1時間インキュベートしました。シグナル生成には、Femto SuperSignal West ECL 試薬 (Thermo Scientific、マサチューセッツ州ウォルサム) を使用しました。免疫染色のために、胚を 4% PFA/PBS 中で一晩固定し、凍結保存しました。組織凍結切片を、1% 正常ヤギ血清 (Thermo Scientific、マサチューセッツ州ウォルサム) および 0.1% Triton X-100 (Sigma-Aldrich、セントルイス、ミズーリ州) を含む PBS でブロックし、その後、インキュベーター内で 4℃ でインキュベートしました。夜。抗抗体および蛍光二次抗体 (1:1000) を用いて 4°C で 1 時間反応させます。染色された切片をProLongゴールド培地(Thermo Scientific、マサチューセッツ州ウォルサム)に置き、Leica TCS SPE共焦点顕微鏡を使用して平面画像を取得しました。各免疫染色は、少なくとも 2 つの変異体胚の肝断面に対する 3 つの独立した実験として実行されました。代表的な実験を示します。
細胞を改変RIPA緩衝液(20 mM Tris-HCl、pH 8.0、1% NP-40、130 mM NaCl、10% グリセロール、2 mM EDTA、およびHALTプロテアーゼ阻害剤(Sigma-Aldrich、セントルイス、ミズーリ州))中でインキュベートした。簡単に説明すると、溶解物をプロテインG磁気ビーズ(Life Technologies、カリフォルニア州カールズバッド)で事前精製し、抗SPECC1LまたはIgGプロテインGプロテインビーズを使用して4℃で一晩インキュベートし、SPECC1Lを抽出するために使用し、抗SPECC1Lを使用してウェスタンブロットを行った。上記のβ-カテニン抗体 示されている co-IP 実験は 4 つの独立した実験の代表です。
固定培養細胞またはマウス胚組織は、カンザス大学医療センターの電子顕微鏡センターに提供されました。簡単に説明すると、サンプルをEMbed 812樹脂(Electron Microscopy Sciences、ペンシルバニア州フォートワシントン)に包埋し、60℃で一晩重合させ、ダイヤモンドブレードを備えたLeica UC7ウルトラミクロトームを使用して80 nmで切片を作成しました。切片は、100 kV Lab6 ガンを備えた JEOL JEM-1400 透過型電子顕微鏡を使用して視覚化しました。
この記事を引用する方法: Wilson, NR et al.SPECC1L の欠損は、スプライスされた関節の安定性の増加と頭蓋神経堤細胞の剥離の減少につながります。科学。6、17735;土井:10.1038/srep17735 (2016)。
サン・ジャンヌ、J.-P.神経堤の誘導と分化。(Springer Science + Business Media; Landes Bioscience/Eurekah.com、2006)。
コルデロ、DR 他動いている頭蓋神経堤細胞: 頭蓋顔面発達におけるそれらの役割。アメリカ医学遺伝学ジャーナル。パート A 155A、270–279、doi:10.1002/ajmg.a.33702 (2011)。
ボーランド、RP 神経クリストパシー：20 年にわたるその成長と発展。小児科医。病理。研究室。薬。17、1–25 (1997)。
Mangold E.、Ludwig KU、Noten MM 口腔顔面裂の遺伝学の画期的な進歩。分子医学の動向 17、725–733、doi:10.1016/j.molmed.2011.07.007 (2011)。
Minu, M. および Riley, FM 頭蓋顔面発達中の頭蓋神経堤細胞の遊走とパターン形成の分子機構。Development 137、2605–2621、doi: 10.1242/dev.040048 (2010)。
Dixon, MJ、Marazita, ML、Beaty, TH、Murray, JK 口唇口蓋裂：遺伝的影響と環境的影響を理解する。当然のコメント。遺伝学 12、167–178、土井: 10.1038/nrg2933 (2011)。
イングラム、CR et al.インターフェロン調節因子 6 (Irf6) 欠損マウスにおける皮膚、四肢、頭蓋顔面領域の異常な形態形成。ナショナルジュネット。38、1335–1340、土井：10.1038/ng1903 (2006)。
Peyrard-Janvid、M. et al.GRHL3 の優勢な変異は、ファン デル ワールド症候群を引き起こし、口腔周皮の発達を障害します。Am J Hum Genet 94、23–32、doi: 10.1016/j.ajhg.2013.11.009 (2014)。
Harris, MJ および Juriloff, DM 神経管閉鎖に欠陥があるマウス変異体のリストを更新し、神経管閉鎖の完全な遺伝的理解に向けて前進します。先天異常の調査。パート A、臨床および分子奇形学 88、653–669、doi: 10.1002/bdra.20676 (2010)。
Fantauzzo, KA & Soriano, P. PI3K 媒介 PDGFRalpha シグナル伝達は、p53 依存性細胞内経路を介して骨格発達における生存と増殖を調節します。Gene Development 28、1005–1017、doi: 10.1101/gad.238709.114 (2014)。
Kopp, AJ、Green, ND、および Murdoch, JN Disheveled: 収束拡張と神経管閉鎖の関係。神経学の動向。26、453–455、土井: 10.1016/S0166-2236(03)00212-1 (2003)。