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317 ステンレス鋼コイルチューブのサプライヤー

ステンレス鋼材の化学成分表

SPACA6 は、哺乳類の有性生殖の際の配偶子融合に重要な精子発現表面タンパク質です。この基本的な役割にもかかわらず、SPACA6 の具体的な機能はほとんど理解されていません。我々は、SPACA6の細胞外ドメインの結晶構造を2.2Åの分解能で解明し、準柔軟なリンカーで結合された4本鎖バンドルとIg様βサンドイッチから構成される2ドメインタンパク質を明らかにした。この構造は、別の配偶子融合関連タンパク質であるIZUMO1に似ており、SPACA6およびIZUMO1を、本明細書でISTスーパーファミリーと呼ばれる受精関連タンパク質のスーパーファミリーの創設メンバーにしている。IST スーパーファミリーは、ねじれた 4 ヘリックス束と一対のジスルフィド結合 CXXC モチーフによって構造的に定義されます。ヒトプロテオームの構造ベースの AlphaFold 検索により、このスーパーファミリーの追加のタンパク質メンバーが同定されました。特に、これらのタンパク質の多くは配偶子の融合に関与しています。SPACA6 の構造と、IST スーパーファミリーの他のメンバーとの関係は、哺乳類の配偶子融合に関する我々の知識に欠けている部分を提供します。
すべての人間の生命は、父親の精子と母親の卵子という 2 つの別個の一倍体配偶子から始まります。この精子は、数百万の精子細胞が女性の生殖管を通過し、さまざまな障害を克服し 1 、受精能獲得を受けるという激しい選択プロセスの勝者です。これにより、精子の運動性と表面成分のプロセスが強化されます 2、3、4。精子と卵子がお互いを見つけたとしても、プロセスはまだ終わっていません。卵母細胞は卵丘細胞の層と透明帯と呼ばれる糖タンパク質の障壁で囲まれており、精子が卵母細胞に入るにはこの障壁を通過する必要があります。精子は、表面接着分子と膜結合酵素および分泌酵素の組み合わせを使用して、これらの最終障壁を克服します5。これらの分子と酵素は主に内膜と先体基質に保存されており、先体反応中に精子の外膜が溶解するときに検出されます6。この激しい旅の最後のステップは、精子と卵子の融合イベントです。このイベントでは、2 つの細胞が膜を融合して 1 つの二倍体生物になります 7。このプロセスは人間の生殖において画期的なものですが、必要な分子相互作用はほとんど理解されていません。
配偶子の受精に加えて、2 つの脂質二重層の融合の化学が広く研究されています。一般に、膜融合はエネルギー的に不利なプロセスであり、2 つの膜を近づけて連続性を破壊し、融合を引き起こす構造変化をタンパク質触媒に必要とします。これらのタンパク質触媒は融合促進剤として知られており、無数の融合系で発見されています。これらは、宿主細胞へのウイルスの侵入（例、HIV-1 の gp160、コロナウイルスのスパイク、インフルエンザ ウイルスのヘマグルチニン）10、11、12、胎盤（シンシチン）13、14、15、および下等真核生物の配偶子形成融合に必要です（植物、原生生物および節足動物における HAP2/GCS1) 16、17、18、19。ヒト配偶子の融合原はまだ発見されていないが、いくつかのタンパク質が配偶子の付着と融合に重要であることが示されている。卵母細胞で発現される CD9 は、マウスとヒトの配偶子の融合に必要な膜貫通タンパク質であり、最初に発見されました 21、22、23。その正確な機能は依然として不明であるが、接着における役割、卵微絨毛上の接着焦点の構造、および/または卵母細胞表面タンパク質の正確な局在が考えられる24、25、26。配偶子融合に重要な 2 つの最も典型的なタンパク質は、精子タンパク質 IZUMO127 と卵母細胞タンパク質 JUNO28 であり、それらの相互会合は、融合前の配偶子の認識と接着における重要なステップです。雄の Izumo1 ノックアウト マウスと雌の Juno ノックアウト マウスは完全に不妊であり、これらのモデルでは精子は卵黄周囲腔に入りますが、配偶子は融合しません。同様に、ヒト体外受精実験において配偶子を抗IZUMO1抗体またはJUNO27,29抗体で処理するとコンフルエンスが減少した。
最近、IZUMO1 および JUNO20、30、31、32、33、34、35 と表現型が類似した精子発現タンパク質のグループが新たに発見されました。精子先体膜関連タンパク質 6 (SPACA6) は、大規模なマウスの突然変異誘発研究で受精に必須であることが確認されました。導入遺伝子を Spaca6 遺伝子に挿入すると非融合性精子が生成されますが、これらの精子は卵周囲腔に浸潤します 36 。その後のマウスでのノックアウト研究により、Spaca6 が配偶子融合に必要であることが確認されました 30,32 。SPACA6 はほぼ精巣のみで発現し、IZUMO1 と同様の局在パターン、つまり先体反応前は精子内膜内にあり、先体反応後に赤道領域に移動します 30,32。Spaca6 ホモログはさまざまな哺乳動物や他の真核生物に存在し 30 、ヒト配偶子融合に対するその重要性は、SPACA6 に対する耐性による in vitro でのヒト受精の阻害によって実証されています 30 。IZUMO1 や JUNO とは異なり、SPACA6 の構造、相互作用、機能の詳細は不明のままです。
ヒトの精子と卵子の融合の根底にある基本的なプロセスをより深く理解し、家族計画や不妊治療の将来の発展に情報を提供できるようにするために、私たちは SPACA6 の構造的および生化学的研究を実施しました。SPACA6 の細胞外ドメインの結晶構造は、4 螺旋バンドル (4HB) と、準柔軟な領域によって接続された免疫グロブリン様 (Ig 様) ドメインを示しています。以前の研究で予測されているように 7,32,37 、SPACA6 のドメイン構造はヒト IZUMO1 のドメイン構造と類似しており、これら 2 つのタンパク質は、三角形のらせん表面を持つ 4HB と一対のジスルフィド結合した CXXC モチーフという珍しいモチーフを共有しています。我々は、IZUMO1 と SPACA6 が、配偶子融合に関連するより大きな、構造的に関連したタンパク質のスーパーファミリーを定義すると提案します。スーパーファミリーに固有の特徴を使用して、AlphaFold 構造ヒトプロテオームの徹底的な検索を実施し、配偶子融合および/または受精に関与するいくつかのメンバーを含む、このスーパーファミリーの追加メンバーを同定しました。現在、配偶子融合に関連するタンパク質の共通の構造折り畳みとスーパーファミリーが存在することが明らかになり、我々の構造はヒト配偶子融合機構のこの重要な側面の分子地図を提供する。
SPACA6 は、1 つの N-結合型グリカンと 6 つの推定上のジスルフィド結合を持つ 1 回膜貫通タンパク質です (図 S1a および S2)。ヒトSPACA6の細胞外ドメイン（残基27〜246）をショウジョウバエS2細胞で発現させ、ニッケルアフィニティー、陽イオン交換、およびサイズ排除クロマトグラフィーを使用してタンパク質を精製しました（図S1b）。精製された SPACA6 外部ドメインは非常に安定で均一です。多角形光散乱（SEC-MALS）と組み合わせたサイズ排除クロマトグラフィーを使用した分析により、計算分子量26.2±0.5 kDaの1つのピークが明らかになりました（図S1c）。これは、SPACA6 単量体外部ドメインのサイズと一致しており、精製中にオリゴマー化が起こらなかったことを示しています。さらに、円二色性（CD）分光法により、融点51.3℃の混合α / β構造が明らかになりました（図S1d、e）。CDスペクトルのデコンボリューションにより、38.6％のαヘリックス要素と15.8％のβストランド要素が明らかになりました（図S1d）。
SPACA6 細胞外ドメインは、ランダムマトリックスシーディング 38 を使用して結晶化され、解像度 2.2 Å のデータセットが得られました (表 1 および図 S3)。フラグメントベースの分子置換と臭化物曝露による SAD フェーズデータを組み合わせて構造決定を行うと (表 1 および図 S4)、最終的な洗練されたモデルは残基 27 ～ 246 で構成されます。構造が決定された時点では、利用可能な実験的構造または AlphaFold 構造はありませんでした。SPACA6細胞外ドメインの大きさは20Å×20Å×85Åで、7本のヘリックスと9本のβストランドで構成され、6つのジスルフィド結合によって安定化された細長い三次折り畳みを持っています（図1a、b）。Asn243 側鎖の末端の弱い電子密度は、この残基が N 結合型グリコシル化であることを示しています。この構造は、N末端の4ヘリックスバンドル（4HB）とC末端のIg様ドメインの2つのドメインで構成されており、それらの間に中間ヒンジ領域があります（図1c）。
a SPACA6の細胞外ドメインの構造。SPACA6 の細胞外ドメインのストリップ図。N 末端から C 末端までの鎖の色は濃い青から濃い赤です。ジスルフィド結合に関与するシステインはマゼンタで強調表示されます。b SPACA6の細胞外ドメインのトポロジー。図 1a と同じ配色を使用します。c SPACA6細胞外ドメイン。4HB、ヒンジ、および Ig 様ドメイン ストリップ チャートは、それぞれオレンジ色、緑色、青色で色付けされています。レイヤーは一定の縮尺で描画されていません。
SPACA6の4HBドメインには4つの主要なヘリックス（ヘリックス1〜4）が含まれており、これらはヘリックスの形で配置され（図2a）、逆平行相互作用と平行相互作用が交互に起こります（図2b）。小さな追加の 1 回転ヘリックス (ヘリックス 1') が束に対して垂直に配置され、ヘリックス 1 と 2 で三角形を形成します。この三角形は、ヘリックス 3 と 4 の比較的密な充填のらせんがねじれた充填でわずかに変形しています (図2a)。
4HB N端子ストリップチャート。b 4 つのヘリックスの束の上面図。各ヘリックスの N 末端は濃い青色、C 末端は濃い赤色で強調表示されています。c 4HB のトップダウンスパイラルホイール図。各残基は一文字のアミノ酸コードで標識された円として示されています。ホイールの上部にある 4 つのアミノ酸のみに番号が付けられています。非極性残基は黄色、極性の非荷電残基は緑色、正荷電残基は青色、負荷電残基は赤色で表示されます。d 4HB ドメインの三角形の面。4HB はオレンジ色、ヒンジは緑色です。両方の挿入図は棒状のジスルフィド結合を示しています。
4HBは、主に脂肪族残基と芳香族残基から構成される内部の疎水性コアに集中しています（図2c）。コアには、Cys41とCys55の間にジスルフィド結合が含まれており、ヘリックス1と2を上向きの三角形で結び付けています（図2d）。ヘリックス1'のCXXCモチーフとヒンジ領域のβヘアピンの先端にある別のCXXCモチーフとの間にさらに2つのジスルフィド結合が形成されました（図2d）。機能が未知の保存的アルギニン残基 (Arg37) は、ヘリックス 1'、1、および 2 によって形成される中空の三角形の内側に位置します。脂肪族炭素原子 Cβ、Cγ、および Cδ Arg37 は疎水性コアと相互作用し、そのグアニジン グループは周期的に移動しますThr32主鎖と側鎖の間の相互作用を介してヘリックス1'と1の間（図S5a、b）。Tyr34 は空洞内に伸び、Arg37 が溶媒と相互作用できる 2 つの小さな空洞を残します。
Ig 様 β サンドイッチ ドメインは、疎水性コアを介して相互作用する 2 つ以上の多本鎖両親媒性 β シートという共通の特徴を共有するタンパク質の大きなスーパーファミリーです 39。SPACA6 の C 末端 Ig 様ドメインも同じパターンを持っています2つの層で構成されています（図S6a）。シート 1 は 4 つのストランド (ストランド D、F、H、および I) からなる β シートであり、ストランド F、H、および I は逆平行配置を形成し、ストランド I と D は並列相互作用をとります。表 2 は、小さな逆平行二本鎖ベータ シート (鎖 E および G) です。E鎖のC末端とH鎖の中心（Cys170-Cys226）の間に内部ジスルフィド結合が観察されました（図S6b）。このジスルフィド結合は、免疫グロブリンの β サンドイッチ ドメインのジスルフィド結合に類似しています 40,41。
4 ストランド β シートは全長に沿ってねじれ、形状と静電気が異なる非対称のエッジを形成します。薄いエッジは平坦な疎水性環境表面であり、SPACA6の残りの不均一で静電気的に多様な表面と比較して際立っています（図S6b、c）。露出した主鎖のカルボニル/アミノ基と極性側鎖のハローが疎水性表面を囲んでいます（図S6c）。より広いマージンは、疎水性コアのN末端部分をブロックし、F鎖骨格の開いた極性基と3つの水素結合を形成する、キャップされたらせんセグメントによって覆われています（図S6d）。このエッジの C 末端部分は、部分的に露出した疎水性コアを備えた大きなポケットを形成します。ポケットは、3 セットの二重アルギニン残基 (Arg162-Arg221、Arg201-Arg205、および Arg212-Arg214) と中央のヒスチジン (His220) による正電荷で囲まれています (図 S6e)。
ヒンジ領域は、ヘリックス ドメインと Ig 様ドメインの間の短いセグメントであり、1 つの逆平行 3 本鎖 β 層 (ストランド A、B、および C)、小さな 310 ヘリックス、およびいくつかの長いランダムなヘリックス セグメントで構成されます。(図S7)。ヒンジ領域における共有結合および静電接触のネットワークにより、4HB と Ig 様ドメイン間の配向が安定化すると思われます。ネットワークは 3 つの部分に分けることができます。最初の部分には、ヒンジの β ヘアピンと 4HB の 1' ヘリックスの間に一対のジスルフィド結合を形成する 2 つの CXXC モチーフ (27CXXC30 および 139CXXC142) が含まれています。2 番目の部分には、Ig 様ドメインとヒンジ間の静電相互作用が含まれます。ヒンジの Glu132 は、Ig 様ドメインの Arg233 およびヒンジの Arg135 と塩橋を形成します。3 番目の部分には、Ig 様ドメインとヒンジ領域間の共有結合が含まれます。2 つのジスルフィド結合 (Cys124-Cys147 および Cys128-Cys153) は、Gln131 と骨格官能基間の静電相互作用によって安定化されるリンカーにヒンジ ループを接続し、最初の Ig 様ドメインへのアクセスを可能にします。鎖。
SPACA6 細胞外ドメインの構造と 4HB および Ig 様ドメインの個々の構造を使用して、タンパク質データベース内の構造的に類似した記録を検索しました 42 。Dali Z スコアが高く、標準偏差が小さく、LALI スコアが大きい (後者は構造的に同等な残基の数) を備えた一致を特定しました。完全な外部ドメイン検索 (表 S1) からの最初の 10 ヒットは、許容可能な Z スコア > 842 でしたが、4HB または Ig 様ドメイン単独の検索では、これらのヒットのほとんどが β サンドイッチのみに対応することが示されました。多くのタンパク質に見られる普遍的なフォールド。大理での 3 つの検索すべてで、IZUMO1 という 1 つの結果のみが返されました。
SPACA6 と IZUMO1 は構造的類似性を共有していることが長い間示唆されてきました 7,32,37。これら 2 つの配偶子融合関連タンパク質の細胞外ドメインは 21% の配列同一性しか共有していませんが (図 S8a)、保存されたジスルフィド結合パターンや SPACA6 の予測される C 末端 Ig 様ドメインなどの複雑な証拠により、初期の試みにより、 IZUMO1を鋳型として用いたSPACA6マウスAの相同性モデル37。私たちの構造はこれらの予測を裏付け、実際の類似度を示しています。実際、SPACA6とIZUMO137,43,44構造は、ヒンジ領域によって接続された同様の4HBおよびIg様βサンドイッチドメインを備えた同じ2ドメイン構造（図S8b）を共有しています（図S8c）。
IZUMO1とSPACA6 4HBには、従来のスパイラルバンドルとの共通の違いがあります。典型的な 4HB は、エンドソーム融合に関与する SNARE タンパク質複合体で見られるものと同様に 45,46、中心軸の周りで一定の曲率を維持する等間隔のヘリックスを持っています 47。対照的に、IZUMO1 と SPACA6 の両方のヘリックスドメインは歪んでいて、曲率が変化しており、不均一なパッ​​キング (図 S8d)。このねじれは、おそらくヘリックス 1'、1、および 2 によって形成される三角形によって引き起こされ、IZUMO1 および SPACA6 に保持され、ヘリックス 1' 上の同じ CXXC モチーフによって安定化されます。ただし、SPACA6 に見られる追加のジスルフィド結合 (上記のヘリックス 1 と 2 を共有結合する Cys41 と Cys55) は、三角形の頂点でより鋭い頂点を作成し、SPACA6 を IZUMO1 よりもよりねじれ、より顕著な空洞三角形を持ちます。さらに、IZUMO1 には SPACA6 のこの空洞の中心に見られる Arg37 が欠如しています。対照的に、IZUMO1 は脂肪族残基と芳香族残基のより典型的な疎水性コアを持っています。
IZUMO1 は、二本鎖および五本鎖の β シートからなる Ig 様ドメインを持っています 43。IZUMO1 の余分な鎖は SPACA6 のコイルを置き換え、F 鎖と相互作用して鎖内のバックボーンの水素結合を制限します。興味深い比較点は、2 つのタンパク質の Ig 様ドメインの予測表面電荷です。IZUMO1 表面は SPACA6 表面よりもマイナスに帯電しています。追加の電荷は、精子膜に面した C 末端近くに位置します。SPACA6では、同じ領域がより中性または正に帯電していました（図S8e）。たとえば、SPACA6 の疎水性表面 (薄いエッジ) と正に帯電したピット (広いエッジ) は、IZUMO1 では負に帯電します。
IZUMO1とSPACA6の間の関係と二次構造要素はよく保存されていますが、Ig様ドメインの構造アライメントは、2つのドメインが互いに対する全体的な方向性が異なることを示しました（図S9）。IZUMO1 の螺旋束は β-サンドイッチの周りで湾曲し、中心軸から約 50°の位置で前述の「ブーメラン」形状を作成します。対照的に、SPACA6 のヘリカルビームは反対方向に約 10°傾斜していました。これらの向きの違いは、ヒンジ領域の違いによるものと考えられます。一次配列レベルでは、IZUMO1 と SPACA6 は、システイン、グリシン、およびアスパラギン酸残基を除いて、ヒンジでの配列類似性をほとんど共有しません。その結果、水素結合と静電ネットワークはまったく異なります。β シートの二次構造要素は IZUMO1 と SPACA6 で共有されていますが、IZUMO1 の鎖ははるかに長く、310 ヘリックス (ヘリックス 5) は SPACA6 に固有です。これらの違いにより、他の点では類似している 2 つのタンパク質のドメインの方向が異なります。
私たちのダリサーバー検索により、タンパク質データベースに保存されている実験的に決定された構造のうち、この特定の4HBフォールドを持つ構造はSPACA6とIZUMO1の2つだけであることが明らかになりました（表S1）。最近では、DeepMind (Alphabet/Google) が、一次配列からタンパク質の 3D 構造を正確に予測できるニューラル ネットワーク ベースのシステムである AlphaFold を開発しました 48。SPACA6 の構造を解明した直後に、AlphaFold データベースがリリースされ、ヒト プロテオームの全タンパク質の 98.5% をカバーする予測構造モデルが提供されました 48,49。解決された SPACA6 構造を検索モデルとして使用し、AlphaFold ヒト プロテオーム内のモデルの構造相同性検索により、SPACA6 および IZUMO1 と構造的類似性がある可能性のある候補が特定されました。SPACA6の予測におけるAlphaFoldの驚異的な精度（図S10a）、特に解明された構造（図S10b）と比較した1.1Å rms外部ドメインを考慮すると、特定されたSPACA6の一致が正確である可能性が高いと確信できます。
以前、PSI-BLAST は、他の 3 つの精子関連タンパク質、IZUMO2、IZUMO3、および IZUMO450 を使用して IZUMO1 クラスターを検索しました。AlphaFold は、これらの IZUMO ファミリータンパク質は Ig 様ドメインを欠いているものの、IZUMO1 と同じジスルフィド結合パターンを持つ 4HB ドメインに折りたたまれると予測しました (図 3a および S11)。IZUMO2とIZUMO3はIZUMO1と同様の片面膜タンパク質であると仮説が立てられていますが、IZUMO4は分泌されるようです。IZUMO 2、3、4 タンパク質の配偶子融合における機能はまだ解明されていません。IZUMO3 は精子発生中の先体生合成に役割を果たすことが知られており 51、IZUMO タンパク質は複合体を形成します 50。哺乳類、爬虫類、両生類における IZUMO タンパク質の保存は、その潜在的な機能が DCST1/2、SOF1、FIMP などの他の既知の配偶子融合関連タンパク質の機能と一致していることを示唆しています。
IST スーパーファミリーのドメイン構造の図。4HB、ヒンジ、Ig 様ドメインがそれぞれオレンジ色、緑色、青色で強調表示されています。IZUMO4は黒色に見える独特のC末端領域を持っています。確認されたジスルフィド結合と推定上のジスルフィド結合は、それぞれ実線と点線で示されています。b IZUMO1 (PDB: 5F4E)、SPACA6、IZUMO2 (AlphaFold DB: AF-Q6UXV1-F1)、IZUMO3 (AlphaFold DB: AF-Q5VZ72-F1)、IZUMO4 (AlphaFold DB: AF-Q1ZYL8-F1)、TMEM95 (AlphaFold) DB: AF-Q1ZYL8-F1) : AF-Q1ZYL8-F1) : AF-Q3KNT9-F1) はパネル A と同じ色範囲で表示されます。ジスルフィド結合はマゼンタで表示されます。TMEM95、IZUMO2、および IZUMO3 の膜貫通ヘリックスは示されていません。
IZUMOタンパク質とは異なり、他のSPACAタンパク質（すなわち、SPACA1、SPACA3、SPACA4、SPACA5、およびSPACA9）は、SPACA6とは構造的に異なると考えられています（図S12）。SPACA9 のみが 4HB を持っていますが、SPACA6 と同じ平行-反平行配向または同じジスルフィド結合を持つとは予想されません。SPACA1 だけが同様の Ig 様ドメインを持っています。AlphaFold は、SPACA3、SPACA4、および SPACA5 は SPACA6 とはまったく異なる構造を持つと予測しています。興味深いことに、SPACA4 も受精において役割を果たすことが知られていますが、その役割は SPACA6 よりも大きく、代わりに精子と卵母細胞の透明帯間の相互作用を促進します 52。
AlphaFold 検索では、IZUMO1 と SPACA6 4HB、TMEM95 に別の一致が見つかりました。単一の精子特異的膜貫通タンパク質である TMEM95 は、切除されると雄マウスを不妊化します 32,33。TMEM95を欠く精子は、正常な形態、運動性、および透明帯を貫通して卵膜に結合する能力を有していたが、卵母細胞膜と融合することができなかった。以前の研究では、TMEM95 が IZUMO133 と構造的類似性を共有していることが示されています。実際、AlphaFoldモデルは、TMEM95がIZUMO1およびSPACA6と同じCXXCモチーフのペアと、SPACA6に見られるヘリックス1と2の間に同じ追加のジスルフィド結合を有する4HBであることを確認しました（図3aおよびS11）。TMEM95にはIg様ドメインがありませんが、SPACA6およびIZUMO1ヒンジ領域と同様のジスルフィド結合パターンを持つ領域があります（図3b）。この原稿の出版時に、プレプリント サーバーは TMEM95 の構造を報告し、AlphaFold53 の結果を確認しました。TMEM95はSPACA6およびIZUMO1に非常に類似しており、両生類ではすでに進化的に保存されています（図4およびS13）。
PSI-BLAST 検索では、NCBI SPACA6、IZUMO1-4、TMEM95、DCST1、DCST2、FIMP、および SOF1 データベースを使用して、生命の樹におけるこれらの配列の位置を決定しました。分岐点間の距離は縮尺どおりに示されていません。
SPACA6 と IZUMO1 の間の驚くべき全体構造類似性は、これらが TMEM95 タンパク質と IZUMO 2、3、および 4 タンパク質を含む保存された構造スーパーファミリーの創設メンバーであることを示唆しています。既知のメンバー: IZUMO1、SPACA6、TMEM95。Ig 様ドメインを有するメンバーは少数であるため、IST スーパーファミリーの特徴は 4HB ドメインであり、これらのタンパク質すべてに共通する独特の特徴があります。 1) 逆平行/平行交互に配置されたヘリックスを持つコイル状 4HB (図.5a), 2) バンドルは、バンドル内の 2 つのヘリックスと 3 番目の垂直ヘリックスで構成される三角形の面を持っています (図の主要領域 (図 5c)。チオレドキシン様タンパク質に見られる CXXC モチーフは、機能することが知られています)酸化還元センサーとして機能する 54,55,56 が、IST ファミリーメンバーのモチーフは配偶子融合における ERp57 などのタンパク質ジスルフィドイソメラーゼと関連付けられる可能性があります。
IST スーパーファミリーのメンバーは、4HB ドメインの 3 つの特徴によって定義されます。平行配向と逆平行配向の間で交互する 4 つのヘリックス、ba 三角形のヘリックス束面、および小分子間に形成される ca CXXC ダブルモチーフです。) N 末端ヘリックス (オレンジ) とヒンジ領域 β ヘアピン (緑色)。
SPACA6とIZUMO1の類似性を考慮して、前者のIZUMO1またはJUNOへの結合能力を試験した。生物層干渉法 (BLI) は、IZUMO1 と JUNO の間の相互作用を定量化するために以前に使用されてきた速度論ベースの結合法です。高濃度のJUNO分析物をベイトとしてIZUMO1とビオチン標識センサーをインキュベートした後、強いシグナルが検出されました（図S14a）、これはセンサーチップに付着した生体材料の厚さの結合誘発性変化を示しています。同様のシグナル（すなわち、IZUMO1分析物に対する餌としてセンサーに結合したJUNO）（図S14b）。SPACA6をセンサー結合IZUMO1またはセンサー結合JUNOに対する分析物として使用した場合、シグナルは検出されませんでした（図S14a、b）。このシグナルが存在しないことは、SPACA6 の細胞外ドメインが IZUMO1 または JUNO の細胞外ドメインと相互作用しないことを示しています。
BLI アッセイはベイトタンパク質上の遊離リジン残基のビオチン化に基づいているため、リジン残基が相互作用に関与している場合、この修飾により結合が妨げられる可能性があります。さらに、センサーに対する結合の方向によって立体障害が生じる可能性があるため、組換え SPACA6、IZUMO1、および JUNO 外部ドメインに対して従来のプルダウン アッセイも実行されました。それにもかかわらず、SPACA6はHisタグ付きIZUMO1またはHisタグ付きJUNOと沈殿せず（図S14c、d）、BLI実験で観察されたものと一致する相互作用がないことを示しています。ポジティブコントロールとして、JUNOと標識His IZUMO1の相互作用を確認しました（図S14eおよびS15）。
SPACA6 と IZUMO1 の構造的類似性にもかかわらず、SPACA6 が JUNO に結合できないことは驚くべきことではありません。ヒトIZUMO1の表面には、3つの領域のそれぞれからの残基を含む、JUNOと相互作用する20以上の残基があります（ただし、それらのほとんどはヒンジ領域に位置しています）（図S14f）。これらの残基のうち、SPACA6 (Glu70) には 1 つだけが保存されています。多くの残基置換は元の生化学的特性を保持していましたが、IZUMO1 の必須の Arg160 残基は SPACA6 の負に荷電した Asp148 に置き換えられました。これまでの研究では、IZUMO1 の Arg160Glu 変異により JUNO43 への結合がほぼ完全に消失することが示されています。さらに、IZUMO1とSPACA6のドメイン配向の違いにより、SPACA6上の同等領域のJUNO結合部位の表面積が大幅に増加しました（図S14g）。
配偶子融合には SPACA6 が必要であること、および IZUMO1 との類似性が知られているにもかかわらず、SPACA6 は同等の JUNO 結合機能を持っていないようです。したがって、私たちは構造データと進化生物学によって提供される重要性の証拠を組み合わせようと努めてきました。SPACA6 ホモログの配列アラインメントは、哺乳類を超えて共通の構造が保存されていることを示しています。例えば、システイン残基は遠縁の両生類にも存在します（図6a）。ConSurf サーバーを使用して、66 配列の複数配列アラインメント保持データを SPACA6 表面にマッピングしました。このタイプの分析は、タンパク質の進化中にどの残基が保存されているかを示し、どの表面領域が機能に役割を果たしているかを示すことができます。
a CLUSTAL OMEGAを使用して調製された12の異なる種からのSPACA6細胞外ドメインの配列アラインメント。ConSurf の分析によると、最も保守的なポジションが青でマークされています。システイン残基は赤色で強調表示されます。ドメイン境界と二次構造要素はアライメントの上部に示されており、矢印はβストランドを示し、波はヘリックスを示します。配列を含む NCBI アクセス識別子は次のとおりです: ヒト (Homo sapiens、NP_001303901)、マンドリル (Mandrilus leucophaeus、XP_011821277)、オマキザル (Cebus mimic、XP_017359366)、ウマ (Equus caballus、XP_023506102)、シャチ (Orcinus orca3) _23 XP_032_034) 。)、ヒツジ (Ovis aries、XP_014955560)、ゾウ (Loxodonta africana、XP_010585293)、イヌ (Canis lupus familyis、XP_025277208)、マウス (Mus musculus、NP_001156381)、タスマニアデビル (Sarcophilus harrisii、XP_03611、 XP_0318)、カモノハシ、8) 、61_89 とウシガエル (Bufo bufo、XP_040282113)。番号付けは人間の順序に基づいています。b SPACA6 構造の表面表現。上部に 4HB、下部に Ig 様ドメインがあり、色は ConSurf サーバーからの保存推定に基づいています。最も保存状態の良い部分は青、中程度に保存されている部分は白、最も保存状態の悪い部分は黄色です。紫色のシステイン。高レベルの保護を示す 3 つの表面パッチが、パッチ 1、2、および 3 とラベル付けされた挿入図に示されています。4HB の漫画が右上の挿入図に示されています (同じ配色)。
SPACA6 構造には、高度に保存された 3 つの表面領域があります (図 6b)。パッチ 1 は 4HB とヒンジ領域に広がり、2 つの保存された CXXC ジスルフィド架橋、Arg233-Glu132-Arg135-Ser144 ヒンジ ネットワーク (図 S7)、および 3 つの保存された外側芳香族残基 (Phe31、Tyr73、Phe137)) を含みます。Ig様ドメインのより広い縁（図S6e）、これは精子表面上のいくつかの正に荷電した残基を表します。興味深いことに、このパッチには、SPACA6 30 の機能を妨害することが以前に示されている抗体エピトープが含まれています。領域 3 はヒンジと Ig 様ドメインの片側に広がっています。この領域には、保存されたプロリン (Pro126、Pro127、Pro150、Pro154) および外側に面した極性/荷電残基が含まれています。驚くべきことに、4HBの表面上の残基のほとんどは非常に可変ですが（図6b）、その折り畳みはSPACA6ホモログ全体（疎水性バンドルコアの保存性によって示されるように）およびISTスーパーファミリーを超えて保存されています。
これは、検出可能な二次構造要素が最も少ない SPACA6 の最小領域ですが、多くのヒンジ領域残存物 (領域 3 を含む) は SPACA6 ホモログ間で高度に保存されており、これはヘリックス束と β サンドイッチの配向が役割を果たしている可能性を示している可能性があります。保守派として。しかし、SPACA6 と IZUMO1 のヒンジ領域には広範な水素結合と静電ネットワークがあるにもかかわらず、IZUMO137、43、44 の複数の許容構造の配列には本質的な柔軟性の証拠が見られます。個々のドメインの整列はよく重なっていましたが、互いに対するドメインの配向は中心軸から50°から70°まで変化しました（図S16）。溶液中のSPACA6の構造動態を理解するために、SAXS実験を実行しました（図S17a、b）。SPACA6外部ドメインのab initio再構成は棒状結晶構造に一致しましたが（図S18）、Kratkyプロットはある程度の柔軟性を示しました（図S17b）。この立体構造は、結合していないタンパク質が格子内でも溶液内でもブーメラン形状をとる IZUMO1 とは対照的です 43。
柔軟な領域を具体的に特定するために、SPACA6で水素重水素交換質量分析（H-DXMS）を実行し、IZUMO143で以前に得られたデータと比較しました（図7a、b）。100,000 秒の交換後の構造全体にわたるより高い重水素交換によって示されるように、SPACA6 は明らかに IZUMO1 よりも柔軟です。どちらの構造でも、ヒンジ領域の C 末端部分は高レベルの交換を示しており、これによりおそらく 4HB ドメインと Ig 様ドメインの互いに対する限定的な回転が可能になります。興味深いことに、147CDLPLDCP154残基からなるSPACA6ヒンジのC末端部分は高度に保存された領域3であり（図6b）、これはおそらくドメイン間の柔軟性がSPACA6の進化的に保存された特徴であることを示している。柔軟性分析によると、CD熱融解データは、SPACA6（Tm = 51.2°C）がIZUMO1（Tm = 62.9°C）よりも安定性が低いことを示しました（図S1eおよびS19）。
a SPACA6 と b IZUMO1 の H-DXMS 画像。重水素交換のパーセンテージは、示された時点で決定されました。水素と重水素の交換レベルは、青 (10%) から赤 (90%) までのグラデーション スケールの色で示されます。黒いボックスは、交換率の高い領域を表します。結晶構造で観察される 4HB、ヒンジ、および Ig 様ドメインの境界は、一次配列の上に示されています。10秒、1000秒、および100,000秒における重水素交換レベルを、SPACA6およびIZUMO1の透明な分子表面に重ね合わせたストリップチャート上にプロットした。重水素交換レベルが 50% 未満の構造の部分は白色で表示されます。H-DXMS 交換が 50% を超える領域は、グラデーション スケールで色付けされます。
CRISPR/Cas9 およびマウス遺伝子ノックアウト遺伝戦略の使用により、精子と卵子の結合および融合に重要ないくつかの因子が同定されました。IZUMO1-JUNO と CD9 構造の相互作用は十分に特徴づけられているが、配偶子融合に関連するタンパク質のほとんどは構造的および機能的に謎のままである。SPACA6 の生物物理学的および構造的特徴付けは、受精中の接着/融合分子パズルのもう 1 つのピースです。
SPACA6 および IST スーパーファミリーの他のメンバーは、個々の鳥類、爬虫類、両生類だけでなく、哺乳類でも高度に保存されているようです。実際、SPACA6 はゼブラフィッシュ 59 の受精にも必要であると考えられています。この分布は、DCST134、DCST234、FIMP31、SOF132 などの他の既知の配偶子融合関連タンパク質と類似しており、これらの因子が HAP2 欠損であることを示唆しています (また、 GCS1 として知られる）タンパク質は、多くの原生生物の触媒活性を担っています。、植物、節足動物。受精融合タンパク質 60、61。 SPACA6 と IZUMO1 の間には強い構造的類似性があるにもかかわらず、これらのタンパク質のいずれかをコードする遺伝子のノックアウトは雄マウスの不妊症をもたらし、配偶子融合におけるそれらの機能が複製されないことを示しています。。より広く言えば、融合の接着段階に必要な既知の精子タンパク質はどれも重複していない。
SPACA6 (およびISTスーパーファミリーの他のメンバー) が配偶者間結合に関与しているのか、配偶者間ネットワークを形成して重要なタンパク質を融合点に動員しているのか、あるいはおそらくとらえどころのない融合促進剤として機能しているのかどうかは、未解決の疑問のままである。HEK293T 細胞における免疫共沈降研究により、全長 IZUMO1 と SPACA632 の間の相互作用が明らかになりました。しかし、我々の組換え細胞外ドメインはインビトロで相互作用しなかった。これは、Noda et al.で見られた相互作用が示唆されている。両方とも構築物中で欠失していた（受精には不必要であることが示されているIZUMO1の細胞質尾部に注目してください62）。あるいは、IZUMO1および/またはSPACA6は、生理学的に特異的な立体構造や他のタンパク質（既知または未発見）を含む分子複合体など、in vitroでは再現できない特異的な結合環境を必要とする可能性があります。IZUMO1 外部ドメインは、卵周囲腔における精子の卵子への付着を媒介すると考えられていますが、SPACA6 外部ドメインの目的は不明です。
SPACA6 の構造は、タンパク質間相互作用に関与している可能性のあるいくつかの保存された表面を明らかにしています。CXXC モチーフにすぐ隣接するヒンジ領域の保存部分 (上記でパッチ 1 と指定) には、生体分子間の疎水性相互作用や π スタッキング相互作用にしばしば関連する、いくつかの外向きの芳香族残基があります。Ig 様ドメインの広い側面 (領域 2) は、高度に保存された Arg および His 残基を含む正に帯電した溝を形成しており、この領域に対する抗体は配偶子融合をブロックするために以前に使用されてきました 30 。この抗体は、6 つのアルギニン残基のうち 3 つと高度に保存された His220 を持つ線状エピトープ 212RIRPAQLTHRGTFS225 を認識します。機能不全がこれらの特定の残基の遮断によるものなのか、それとも領域全体によるものなのかは明らかではありません。βサンドイッチのC末端近くのこのギャップの位置は、隣接する精子タンパク質とのシス相互作用を示すが、卵母細胞タンパク質とはシス相互作用を示さない。さらに、ヒンジ内にプロリンに富んだ柔軟性の高いもつれ（部位 3）が保持されているのは、タンパク質間相互作用の部位である可能性があり、あるいは、2 つのドメイン間の柔軟性の保持を示している可能性が高くなります。SPACA6 の未知の役割にとって性別は重要です。配偶子の融合。
SPACA6 は、Ig 様 β サンドイッチなどの細胞間接着タンパク質の特性を備えています。多くの接着タンパク質 (カドヘリン、インテグリン、アドヘシン、IZUMO1 など) は、タンパク質を細胞膜から環境標的まで拡張する 1 つ以上の β サンドイッチ ドメインを持っています 63、64、65。SPACA6 の Ig 様ドメインには、接着と凝集の β サンドイッチに一般的に見られるモチーフ、つまり機械的クランプとして知られる β サンドイッチの端にある平行な鎖のダブレットも含まれています 66。このモチーフはせん断力に対する抵抗を増加させると考えられており、これは細胞間相互作用に関与するタンパク質にとって貴重です。しかし、この付着因子との類似性にもかかわらず、SPACA6 が卵白と相互作用するという証拠は現時点ではありません。SPACA6 外部ドメインは JUNO に結合できず、SPACA6 発現 HEK293T 細胞は、ここで示されているように、透明帯を欠く卵母細胞とほとんど相互作用しません 32 。SPACA6 が配偶体間結合を確立する場合、これらの相互作用には翻訳後修飾や他の精子タンパク質による安定化が必要になる可能性があります。後者の仮説を支持するものとして、IZUMO1欠損精子は卵母細胞に結合し、IZUMO1以外の分子が配偶子の接着段階に関与していることが実証されている 27 。
多くのウイルス、細胞、発生融合タンパク質には、融合原としての機能を予測する特性があります。たとえば、ウイルス融合糖タンパク質 (クラス I、II、および III) は、宿主膜に挿入されるタンパク質の末端に疎水性融合ペプチドまたはループを持っています。IZUMO143 の親水性マップと IST スーパーファミリーの構造 (決定および予測) では、明らかな疎水性融合ペプチドは示されませんでした。したがって、IST スーパーファミリーのタンパク質が融合原として機能する場合、それらは他の既知の例とは異なる方法で機能します。
結論として、配偶子融合に関連するタンパク質の IST スーパーファミリーのメンバーの機能は依然として興味深い謎です。私たちが特徴づけた SPACA6 組換え分子とその解明された構造は、これらの共有構造と配偶子の付着および融合における役割の間の関係についての洞察を提供します。
予測されたヒト SPACA6 細胞外ドメイン (NCBI アクセッション番号 NP_001303901.1; 残基 27 ～ 246) に対応する DNA 配列は、キイロショウジョウバエ S2 細胞での発現のためにコドン最適化され、Kozak (Eurofins Genomics) をコードする配列を持つ遺伝子断片として合成されました。、BiP 分泌シグナル、および対応する 5' および 3' 末端は、ピューロマイシンによる選択用に修飾されたメタロチオネイン プロモーター (pMT-puro) に基づく pMT 発現ベクターへのこの遺伝子のライゲーション非依存的クローニングに使用されます。pMT-puro ベクターは、トロンビン切断部位とそれに続く 10x-His C 末端タグをコードします (図 S2)。
SPACA6 pMT-puro ベクターのキイロショウジョウバエ S2 (Gibco) 細胞への安定したトランスフェクションを、IZUMO1 および JUNO43 に使用したプロトコールと同様に実行しました。S2細胞を解凍し、最終濃度10％（v/v）の熱不活化ウシ胎児血清（Gibco）および1X抗真菌性抗生物質（Gibco）を添加したシュナイダー培地（Gibco）中で増殖させた。初期継代細胞（3.0×106細胞）を6ウェルプレート（Corning）の個々のウェルに播種した。27℃で24時間インキュベートした後、メーカーのプロトコールに従って、2 mgのSPACA6 pMT-puroベクターとEffecteneトランスフェクション試薬(Qiagen)の混合物を用いて細胞をトランスフェクトした。トランスフェクトされた細胞を72時間インキュベートし、その後6 mg/mlのピューロマイシンを用いて回収した。次いで、細胞を完全シュナイダー培地から単離し、大規模なタンパク質生産のために無血清のInsect-XPRESS培地（Lonza）に入れました。1 L バッチの S2 細胞培養物を 2 L の通気付き平底ポリプロピレン三角フラスコ内で 8 ～ 10 × 106 ml-1 細胞まで増殖させた後、最終濃度 500 μM C​​uSO4 (Millipore Sigma) で滅菌し、滅菌濾過しました。誘発された。誘導された培養物を２７℃、１２０ｒｐｍで４日間インキュベートした。
ＳＰＡＣＡ６を含む馴化培地を、４℃、５６６０×ｇでの遠心分離、続いて１０ｋＤａ ＭＷＣＯ膜を備えたＣｅｎｔｒａｍａｔｅタンジェンシャルフロー濾過システム（Ｐａｌｌ Ｃｏｒｐ）によって単離した。SPACA6 を含む濃縮培地を 2 ml Ni-NTA アガロース樹脂 (Qiagen) カラムに適用します。Ni-NTA樹脂を10カラム容量(CV)の緩衝液Aで洗浄し、次いで1CVの緩衝液Aを添加して、最終イミダゾール濃度50mMを得た。SPACA6を、最終濃度500mMまでイミダゾールを補充した10mlの緩衝液Aで溶出した。制限クラスのトロンビン (Millipore Sigma) を、透析用の 1 L 10 mM Tris-HCl、pH 7.5 および 150 mM NaCl (緩衝液 B) に対して、SPACA6 1 mg あたり 1 単位で透析チューブ (MWCO 12-14 kDa) に直接添加しました。) 4℃で48時間。次に、トロンビンで切断されたSPACA6を3倍に希釈して塩濃度を下げ、10 mM Tris-HCl、pH 7.5で平衡化した1 mlのMonoS 5/50 GL陽イオン交換カラム(Cytiva/GE)にロードした。カチオン交換体を３０Ｋの１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ７．５で洗浄し、次いでＳＰＡＣＡ６を、１０ｍｍ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ７．５中の０～５００ｍｍ ＮａＣｌの直線勾配で２５ＯＫで溶出した。イオン交換クロマトグラフィーの後、SPACA6を1mlに濃縮し、緩衝液Bで平衡化したENrich SEC650 10×300カラム(BioRad)から均一濃度で溶出した。クロマトグラムに従って、SPACA6を含む画分をプールし、濃縮した。純度は、16% SDS-ポリアクリルアミドゲルでのクーマシー染色電気泳動によって制御されました。タンパク質濃度は、ランベルトベールの法則と理論上のモル吸光係数を使用して、280 nm での吸光度によって定量化されました。
精製したSPACA6を10mMリン酸ナトリウム、pH7.4および150mM NaFに対して一晩透析し、CD分光法による分析前に0.16mg/mLに希釈した。波長185〜260nmのCDのスペクトル走査は、光路長1mmの石英キュベット(Helma)を使用し、25℃で50nm/分の速度でJasco J-1500分光偏光計で収集されました。CD スペクトルはベースライン補正され、10 回の取得で平均され、平均残留楕円率 (θMRE) 度 cm2/dmol に変換されました。
ここで、MW は各サンプルの分子量 (Da) です。N はアミノ酸の数です。θ はミリ度単位の楕円率です。dはcm単位の光路長に相当します。タンパク質濃度を単位で表したもの。