347 ステンレス鋼コイル状チューブの化学成分、架橋質量分析 (CLMS) を使用した新規インターフェロン応答性ヒト白血球抗原 A (HLA-A) シャペロンタンパク質の同定

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製品説明

ステンレス鋼 347L コイルチューブ、鋼グレード: SS347L

インターフェロンシグナル伝達系は、環境からの広範囲の病原性および固有の病理学的シグナルに対する強力なサイトカイン応答を誘導し、その結果、インターフェロン誘導性タンパク質のサブセットが誘導されます。我々は、DSS 媒介クロスリンク質量分析 (CLMS) を適用して、インターフェロン誘導性タンパク質のドメインにおける新しいタンパク質間相互作用を検出しました。予想されるインターフェロン誘導性タンパク質に加えて、MX1、USP18、OAS3、STAT1などの標準的なインターフェロン誘導性タンパク質の新規な分子間および分子内架橋付加体も同定しました。我々は、免疫共沈降法を用いたHLA-Aタンパク質（H2BFS-HLA-A-HMGA1）によって形成されるインターフェロン誘導性タンパク質ネットワークの新規セットの直交検証と、分子動力学モデリングを用いたさらなる研究に焦点を当てた。タンパク質複合体の構造動態のモデリングにより、CLMS の所見で特定された相互作用を反映するいくつかの相互作用部位が明らかになりました。私たちは共同して、インターフェロンによって誘導される新しいシグナル伝達複合体を同定するための CLMS のパイロット研究を発表し、腫瘍微小環境におけるタンパク質相互作用の新しい動態を同定するために CLMS がより広範に使用されることを期待しています。
適応免疫応答が始まる前に、宿主の先天性防御システムは、インターフェロン (IFN) と呼ばれる分泌型αヘリックス サイトカインのファミリーによって媒介される抗菌応答を開始します。I 型 IFN クラスの IFNα および IFNβ は、抗ウイルス状態、アポトーシス促進状態、炎症促進状態、および抗増殖状態を含む細胞応答を活性化します。ヒトでは、IFNα の 13 のサブタイプが知られており、すべて染色体 91 上にクラスター化されています。驚くべきことに、臨床使用について研究されているのは IFNα2 だけです。最近、IFNα の他のサブタイプに関する研究に特別な注意が払われています。最近の研究では、IFNα14 が標準的な IFNα2 サブタイプと比較して、HBV2 および HIV-13,4 の複製を制限するのに最も効果的なアイソフォームの 1 つであることが示されました。
活性化された I 型インターフェロン受容体複合体 (IFNAR1 および IFNAR2) が、ヤヌスキナーゼ TYK2 および JAK15,6 によって媒介されるシグナル伝達カスケードを引き起こすことが確立されています。これらのヤヌスキナーゼは、シグナル伝達物質および転写タンパク質活性化因子 (STAT1 および STAT2) のチロシン残基をリン酸化し、SH2 ドメイン媒介のヘテロ二量体化を開始します6。その後、IRF9 は STAT ヘテロ二量体に結合して IFN 刺激因子 3 遺伝子 (ISGF3) の三量体複合体を形成し、これが核に移行して 2,000 を超えるインターフェロン刺激遺伝子 (ISG) の転写を誘導します 5、6、7、8。
ISG は、特にウイルス攻撃に応答する自然免疫系のバックボーンを形成します。ウイルス感染に対する防御の第一線として、細胞は細胞タンパク質と幅広い生物学的活性との広範な相互作用を迅速に展開します。これらのタンパク質には、パターン認識受容体、シグナル伝達分子、転写因子、直接的な抗ウイルス機能を持つタンパク質、免疫応答の負の制御因子が含まれます9。ISG 活性に関する情報の多くは、過剰発現スクリーニング 10,11 または遺伝子サイレンシング技術 (siRNA、RNAi、CRISPR) 12,13 を使用した機能スクリーニングから得られており、個々の ISG が発現または阻害され、その活性がさまざまなウイルスでテストされます。これらの研究により、個々の ISG の抗ウイルス特性が決定されましたが、各 ISG の根底にある分子機構はほとんど不明のままです。多くのタンパク質は完全な活性を確保するために 1 つ以上のサイトカインと相互作用するため、ISG は直接相互作用するか、それらの相互作用は細胞タンパク質によって媒介されることが一般に受け入れられています。例えば、最近の光架橋プロテオミクス研究では、ATPアーゼ VCP/p97 が主要な IFITM3 相互作用パートナーであることが特定され、その阻害によりリソソーム選別、代謝回転、およびウイルス粒子との IFITM3 の共輸送の欠陥が引き起こされます 14 。免疫沈降法を使用して、小胞関連タンパク質である VAPA が、コレステロール媒介ウイルス成熟を媒介する IFITM1/2/3 との相互作用パートナーであることを同定しました。これは、酵母ツーハイブリッド システムを使用した別の研究によって確認されました。科学的サポート 15、16。
感染および悪性転換の抑制に関与する基本的な生物学的プロセスは、主要組織適合性複合体 (MHC) 分子によって媒介される抗原提示です。切断された、途中で終結した、またはミスフォールドされたタンパク質からのペプチド（8～12アミノ酸長）は、MHC-Iヘテロ二量体（MHC-I重鎖と軽鎖からなり、β-2-ミクログロブリン; β2Mと呼ばれる）にロードされます 17,18 。結果として生じる安定な MHC-I 三量体は細胞表面に輸送され、そこで細胞内ペプチドを CD8+ T 細胞 (細胞傷害性 T 細胞) に提示します 17。T細胞は、これらの病原体や腫瘍特異的抗原を保有する細胞を認識し、破壊します。その結果、病原体や腫瘍細胞は免疫監視を避けるために抗原提示プロセスを抑制することがよくあります。さらに、MHC-I はヒト腫瘍の 40 ～ 90% で下方制御されており、多くの場合、予後不良と関連しています 19。
病原体への応答に関与する遺伝子は、休止状態と活性転写状態の間で迅速に切り替わらなければなりません。したがって、プロモータークロマチンのリモデリングや修飾など、いくつかの細胞タンパク質が、短期間にわたる高いIFN需要への応答に関与していると仮説が立てられています 20,21 。ほとんどの研究は、IFN 存在下での個々の ISG タンパク質パートナーの同定に焦点を当てています。モデル細胞系におけるいくつかのプロテオミクスおよびトランスクリプトーム研究により、細胞景観に対する IFN の影響が解明されています。しかし、インターフェロンによって引き起こされる動態については理解が進んでいるにもかかわらず、ISG の関与についてはまだほとんどわかっていません。インターフェロンシグナル伝達の複雑さと時間依存性のダイナミクスを考慮すると、2 つの疑問が生じます: (i) 高速シグナル伝達に関与する多タンパク質複合体を安定化してトラップすることは可能か、(ii) これらの相互作用は 3D 空間にマッピングできるか?
これらの問題に対処するために、我々は質量分析法 (CLMS) と組み合わせたジスクシンイミド スベリン酸媒介化学架橋 (DSS) を実装し、IFNα 誘発タンパク質相互作用ネットワークとその動態を研究しました。DSS は、生体内でタンパク質および/またはタンパク質複合体の近位残基間に共有結合を追加します。その後の MS 分析により、内部結合と呼ばれる特定のタンパク質内の領域、または相互関係と呼ばれるタンパク質複合体のサブユニットの空間的近接性を反映する特定の架橋部位が明らかになります。このアプローチを使用して、我々は、いくつかの新規なタンパク質-タンパク質複合体およびインターフェロン誘導性多タンパク質相互作用ネットワークを同定した。これらの新しい相互作用のサブセットをさらにテストすることにより、H2BFS (H2B ヒストン型 FS、以下 H2B と呼びます) と MDN1 が HLA-A の結合パートナーとして機能することを実証します。
Flo-1 細胞は、食道腫瘍の主要な特徴を模倣するため、食道腺癌の最もよく知られた in vitro モデルの 1 つです 22,23。ただし、すべての腫瘍に免疫原性があるわけではないため、Flo-1 細胞がインターフェロン治療に応答するかどうかを確認するために、Flo-1 細胞を 10 ng/ml IFNα で 72 時間処理しました。Flo-1 細胞は、pSTAT1 および IRF1 の早期誘導を示し、処理の 2 時間後に開始し、72 時間継続し、IRF1 の定常レベルは時間依存的に減少しました (図 1A)。ISG (MX1、IFITM1、OAS1/2、および ISG15) は 6 時間後に強く誘導され、IFNα に対する古典的な中期および後期反応を模倣することがわかりました (図 1A)。これらのデータを総合すると、この細胞モデルをインターフェロン応答の研究に使用できることが示唆されます。
IFNα処理後のFlo-1細胞における示差的なタンパク質発現応答。(A) 10 ng/ml IFNαで2、6、24、48および72時間処理したFlo-1細胞におけるタンパク質発現を、示されたISG抗体を使用したイムノブロットによって分析しました。(B) 示された時間および濃度で DSS で架橋した後の全細胞抽出物のクーマシー ブルー染色した SDS-PAGE ゲル。(C) タンパク質の架橋度を評価するために、同じサンプルからの p53(DO-1) 抗体を用いて調べた代表的な免疫ブロット。
in situ のタンパク質相互作用の状況を捉えるために、高い膜透過性と比較的短い反応時間により広く使用されている架橋剤である DSS を使用しました。反応時間が短いと、架橋タンパク質の大きな凝集体の形成が防止され、それによって架橋剤の安定性が維持されます。最適な DSS 濃度を決定し、過剰な架橋を回避するために、まず細胞を 5、2.5、1 mM DSS にそれぞれ 5、10、5、30 分間曝露し、クーマシー染色 SDS-PAGE で溶解物を分析しました。 (データは示されていません)。細胞溶解物は、最低濃度および最短時点で高度に架橋されているように見えます。したがって、DSS を 5 分間かけて 1、0.5、および 0.1 mM に滴定しました (図 1B)。0.5 mM DSS を 5 分間使用すると最適な架橋が観察され、IFNα で処理した細胞にはこれらの条件が選択されました。さらに、図 1C は、タンパク質の架橋の程度を評価するために p53 (DO-1) 抗体を使用して実行されたウェスタンブロットを示しています。
Flo-1 細胞を 10 ng/ml IFNα で 24 時間処理した後、架橋剤を添加しました。続いて、架橋細胞は 2 段階のタンパク質分解によって溶解され、タンパク質は FASP によって処理されました (図 2)24、25。架橋トリプシンペプチドを質量分析法で分析しました (図 2)。その後、MS/MS スペクトルはタンパク質配列と照合され、MaxQuant で定量化されます26、27。SIM-XL プログラムを使用して、得られたスペクトルから架橋ペプチドを同定し、xQuest28 および SIM-XL29 オープンソース コンピューティング ソフトウェア パイプラインを使用して、個々の化合物を複雑なネットワークに結合しました (図 2)。SIM-XL は、単純または複雑なタンパク質混合物におけるタンパク質間相互作用、内部鎖、および個々の鎖を識別し、タンパク質構造の相互作用を視覚化するためのスクリプトを提供します。さらに、MS/MS29 スペクトルの品質に応じて、各相互参照を ID スコアとしてランク付けします。いくつかの信頼性の高いタンパク質間相互作用および複合体が同定されており、分子動力学 (MD) モデリングを使用した免疫共沈降および複合体の立体構造変化を使用して、新しい一連の相互作用がさらに研究されています (図 2) 30、31。
CLMS 法の概略図。Flo-1 細胞を 10 ng/ml IFNα で 24 時間処理した後、DSS を使用して in situ タンパク質架橋を行い、その後細胞溶解およびトリプシン処理を行いました。架橋サンプルは Orbitrap 質量分析計を使用して分析され、LC-MS/MS 中にペプチド前駆体の断片化のためにさらにサンプリングされました。架橋ペプチドのスペクトル認識マシン (SIM-XL) プログラムを使用して、得られたスペクトルから 2 つの結合ペプチドを同定し、計算パイプラインを使用してすべての化合物を複雑なネットワークに結合しました。偽陽性率 (FDR) スコアに基づいて信頼性の低い相互作用をフィルターで除外します。免疫共沈降法を使用して、いくつかの新しい高忠実度のタンパク質間相互作用がさらに確認され、分子動力学 (MD) モデリングを使用して複合体の構造変化が調べられました。
MaxQuant を使用して、刺激されていない IFNα サンプルと刺激された IFNα サンプルでそれぞれ合計約 30,500 個と約 28,500 個のペプチドが検出されました (補足表 S1、図 3A)。どちらの場合でも、ペプチドの長さの分布はより大きなペプチドの割合が高く、架橋ペプチドの存在を示しています (図 3B、C)。さらに、IFNα 処理サンプルでは、​​より大きなペプチドのより大きな割合が 40 ～ 55 の範囲に存在していました (図 3C)。log2 強度に対するタンパク質マッピングでは、MX1、IFIT1/3、OAS2/3、DDX58、HLA-F などの未処理サンプルと比較して、古典的なインターフェロン刺激タンパク質が最も豊富であることが示されました (図 3D)。Reactome 経路データベースを使用して、IFNα 処理に応答して 3 倍以上濃縮されたタンパク質の経路を解析したところ、MHC-I を介した抗原提示とプロセシングが最も主要な経路であることが示されました (図 3E)。以前の報告と一致して、OAS および ISG15 によって媒介される抗ウイルス応答、ならびに IFNα/β およびサイトカインシグナル伝達が活性化される経路の 1 つでした。さらに、SIM-XL を使用して最初に取得した MS/MS スペクトルから、リジンおよびセリンに特異的なタンパク質の架橋が同定されました。最近の研究では、5 種類の細胞における個々の ISG 過剰発現研究のメタアナリシスにより、9 つのウイルス クラスの 20 ウイルスにわたる 104 の ISG が報告されました9。しかし、大規模なデータセットをスクリーニングする計算上の限界を克服するために、我々はより小規模なデータセットから始めて、Padariaらによって報告されたIRDS遺伝子のリスト（そのほとんどがISG）間の相互作用の可能性を調査しました。
IFNαに応答して発現の異なる架橋タンパク質の同定 (データはMaxQuantから取得)。(A) IFNα14 処理および未処理の Flo-1 サンプルで同定された共通ペプチドおよび排他的なペプチドの数を表すベン図。未処理 (B) および IFNα 処理 (C) 架橋サンプルのペプチド長分布。(D) 未処理の Flo-1 細胞と IFNα14 で処理した Flo-1 細胞間の log2 (LFQ 強度) を表すヒート マップ。左のパネルは、IFNαの存在下で最も活発に活性化されるタンパク質を示しています。(E) IFNα 処理後の 20 の主要な濃縮経路を表すヒストグラム。Reactome 経路データベースは、上方制御された IFNα 応答性タンパク質の 4 倍を超える変化を分析しました。
インターフェロン媒介の ISG 刺激については十分に文書化されていますが、分子レベルでは、これらのタンパク質がどのようにして広範囲の生物学的機能に至るのかはほとんど理解されていません。我々は、既知の ISG 間のタンパク質相互作用を高い信頼度で調査しました。興味深いことに、我々は、IFNα治療に応答して大きな複合体を形成するMX1、USP18、ROBO1、OAS3、およびSTAT1タンパク質を含むネットワークを特定しました（図4、表S2）32、33、34。最も重要なことは、これらの相互作用は IFNα で処理したすべての 3 つ組で見出され、未処理のサンプルでは見出されず、これらの相互作用が IFNα 処理に特異的に反応して形成されたことを示唆しています。STAT1 がこれらの ISG の発現を転写的に調節していることは知られていますが、タンパク質レベルでの STAT1 と ISG との相互作用は研究されていません。STAT1 の結晶構造は、そのヘリックス ドメイン (CCD) が二量体形成中の DNA またはプロトマーとの相互作用に関与していないことを示しました 35。これらのαヘリックスは、相互作用が起こるための大部分が親水性の表面積を提供する螺旋構造を形成します 35 。CLMS データでは、STAT1 との相互作用のほとんどが、CCD に先行する SH2 ドメイン、リンカー ドメイン、または C 末端テール (残基 700 ～ 708) で発生していることが観察されました (図 4A)。以前の研究では、USP18がSTAT2のCCDおよびDNA結合ドメイン(DBD)に結合し、I型インターフェロン受容体IFNAR2のサブユニットに動員されてI型インターフェロンシグナル伝達の阻害を媒介することが報告されている 24 。我々のデータは、USP18の触媒ドメインがSTAT1 DBDと相互作用することも示しており（図4A、D）、STAT1とSTAT2の両方がUSP18をIFNAR2に誘引する役割を果たしている可能性があることを示唆しています。
IFNαで処理した架橋細胞で同定されたタンパク質間ISGネットワ​​ーク。(A) タンパク質間相互作用 (SIM-XL プログラムで生成) を示す 2D 相互作用プロット。線は分子間相互作用 (架橋カットオフを 3.5 に設定) を表します。異なる ID のドメインは color32 でマークされます。MX1 ドメイン、Dynamin_N (73 ～ 249)、Dynamin_M (259 ～ 547)、および GED (569 ～ 660)。OAS3 ドメイン: OAS1_C (160-344)、OAS1_C (559-745)、NTP_transf_2 (780-872)、および OAS1_C (903-108)。ドメイン ROBO1、Ig_3 (67 ～ 151)、I-set (170 ～ 258)、I-set (262 ～ 347)、Ig_3 (350 ～ 432)、Ig_3 (454 ～ 529)、fn3 (562 ～ 646)、fn3 (678–758) および fn3 (777–864)。STAT1 フィールド: STAT_int (2 ～ 120)、STAT_alpha (143 ～ 309)、STAT_bind (321 ～ 458)、SH2 (573 ～ 657)、および STAT1_TAZ2bind (715 ～ 739)。(B) 相互作用を含む架橋タンパク質 (MX1、UBP18、OAS3、ROBO1、STAT1) の円形ビューアー。相互作用はそれぞれ青と赤でラベル付けされています。クロスリンク閾値は 3.5 に設定されました。ドット プロットは、STAT1 と MX1 (C)、USP18 (D)、ROBO1 (E)、および OAS3 (F) の相互作用部位、および 2 つのペプチド間の K または S 相互作用部位を示します。この図では、クロスリンク スコアのしきい値は 3.0 に設定されています。(G) PyMol (PyMOL 分子グラフィックス システム、バージョン 2.0 Schrödinger, LLC.) のタンパク質構造に重ねられた STAT1 と OAS3 DI ドメイン間のさまざまな相互作用部位。STAT1 (PDB ID: 1bf533) および OAS3 (PDB ID: 4s3n34)。）プログラム。
ヒトでは USP18 の 2 つのアイソフォームが報告されています。1 つは主に核に存在する完全長タンパク質、もう 1 つは N 末端ドメインを持たないアイソフォームである USP18-sf で、細胞質と核に均一に分布しています 36 。さらに、N 末端は非構造化されており、イソペプチダーゼ活性や ISG1537 結合を必要としないことが予測されました。私たちの研究で特定された相互作用のほとんどはタンパク質のN末端に位置しており、これらの相互作用には全長USP18が関与しており（図4A、D）、したがって核内で発生する可能性が高いことが示唆されています。さらに、我々のデータは、N末端がタンパク質間の相互作用に特化していることも示しています。IFNAR2結合部位は残基312～368の間に位置し、注目すべきことに、複合体中のどのタンパク質もこの領域に結合しない(図4A) 37、38 。これらのデータを総合すると、IFNAR2 結合ドメインが受容体タンパク質によってもっぱら使用されることが示されます。さらに、OAS3 および ROBO1 のみが、N 末端および IFNAR2 結合部位の上流のドメインと関連していることが判明しました (図 4A)。
ROBO1 は膜貫通シグナル伝達分子の免疫グロブリン (Ig) スーパーファミリーに属し、細胞外領域の 5 つの Ig ドメインと 3 つのフィブロネクチン (Fn) ドメインで構成されます。これらの細胞外ドメインの後には、膜近位領域と単一膜貫通ヘリックスが続きます 39。非構造化細胞内領域は C 末端に位置し、エフェクタータンパク質の結合を媒介する保存された配列モチーフを含みます 39。アミノ酸約 1100 から 1600 までの領域はほとんどが無秩序です。我々は、MX1がIg、Fn、および細胞内ドメインを介してROBO1と相互作用するのに対し、STAT1とのほとんどの相互作用はCCD、リンカードメイン、およびROBO1のC末端の間で起こることを発見しました（図4A、E）。一方、DI、DIII、およびOAS3リンカー領域との相互作用はROBO1タンパク質全体に分布していました（図4A）。
オリゴアデニレートシンターゼ (OAS) タンパク質ファミリーは、細胞内二本鎖 RNA (dsRNA) を受け入れて結合し、構造変化を受けて、2',5'-結合オリゴアデニレート (2-5 As) を合成します 40 。3 つの OAS の中で、OAS3 は dsRNA に対して最も高い親和性を示し、RNase L を活性化してウイルス複製を制限する可能性がある 2-5 As の合成量が最も少ないことが判明しました 41 。OAS ファミリーは、ポリメラーゼ ベータ (pol-β) 様のヌクレオチド トランスフェラーゼ ドメインで構成されます。これまでの研究では、C 末端ドメイン (DIII) の触媒活性が、OAS342 の活性化に必要な dsRNA 結合ドメイン (DI) に依存していることが示されています。OAS3 の DI および DII ドメインが CCD および SH2 と STAT1 TAD の間の小さな接合領域と相互作用することを観察しました (図 4A、F)。タンパク質構造上に異なる架橋部位を重ねると、βシートとDBD STAT1ループと、OAS3のDIドメインの残基60〜75によって形成されるオープンポケットまたはキャビティとの間の相互作用が明らかになった（図4G）。複合体中のタンパク質の配向は、OAS3との相互作用がそのDIドメインのDNA結合能力を妨げないことも示しました（図S1A）。さらに、GTPase MX1 の N 末端ドメインは、OAS3 の DI および DIII ドメインと広範囲に相互作用します (図 4A)。また、3 つの IFNα 処理リピートすべてで OAS1 と MX1 の間の相互作用が観察され、単一の OAS1 ドメイン (触媒活性もある) が 3 つの MX1 ドメインすべてと相互作用しました (図 S2A、B)。
MX タンパク質は、GTP に結合して加水分解する N 末端 GTPase ドメイン、自己集合を媒介する中間ドメイン、および GTPase (LZ) として機能する C 末端ロイシン ジッパーを含む、ダイニン様 GTPase の大きなファミリーの一部です。 ）。ドメインエフェクタードメイン25,43。MX1 はウイルスポリメラーゼのサブユニットに結合してウイルス遺伝子の転写をブロックします 43。以前に報告された酵母ツーハイブリッドスクリーニングでは、PIAS1関連MX1がDNA結合活性をブロックすることによりSTAT1媒介遺伝子活性化を阻害し、SUMO E344,45リガーゼ活性も有することが示された。ここでは、MX1 が STAT1 に結合することを示します (図 4C、D)。ただし、この相互作用が IFNα に応答した STAT1 媒介遺伝子活性化にどのように影響するかについてはさらなる研究が必要です。さらに、MX1が3つのIFNα処理リピートすべてでIFIT3およびDDX60と相互作用することもわかりました（図S2C）。
DDX60 は、IFN 誘導性の細胞質ヘリカーゼであり、RIG-I 非依存性のウイルス RNA の分解に役割を果たすことが以前に報告されています 46。DDX60 は RIG-I と相互作用し、リガンド特異的な方法でそのシグナル伝達を活性化します 46。DDX60 は、ウイルス RNA と DNA に結合する DEXD/H-Box ヘリカーゼ ドメインと C 末端ヘリカーゼ ドメインで構成されます 47。MX1およびIFIT3との相互作用のほとんどは、標準的なドメインやモチーフのない長いN末端領域およびC末端領域内で発生します（図S2E、F）。ただし、MX1 は DEXD/H-Box ヘリカーゼドメインにも関連付けられています (図 S2E)。IFIT ファミリーのタンパク質は、テトラペプチド リピート (TPR) と呼ばれる特徴的なヘリックス-ターン-ヘリックス モチーフのタンデム コピーを持っています。IFIT3 は RIG-I シグナル伝達の正のモジュレーターであり、したがって MAVS 複合体の構成要素であることが判明しました。まとめると、我々のデータは、IFIT3とDDX60が主にIFIT3のTPR3〜6の間の領域で相互作用し、RIG-I / MAVSシグナル伝達に役割を果たしている可能性があることを示唆しています（図S2F）。
プロテオーム全体のスクリーニングは計算集約的であることを考慮して、次に、ヒト UniProt データベース全体をスクリーニングして、IFNα 処理リピートの 1 つの存在を調べました。このレプリカでは、HLA-A の信頼性の高い相互作用ネットワークがいくつか見つかりました。MS/MSスペクトルによって同定されたタンパク質経路の分析により、MHC-Iに基づく抗原プロセシングおよび提示がインターフェロンによって誘導される主要な経路であることが示された(図3D)。したがって、我々は、すべての架橋サンプルにおいて高い信頼性を持って MHC-I 分子のタンパク質相互作用を研究することに焦点を当てました。HLA はα1、α2、α3 ドメインと軽鎖から構成され、ミクログロブリン β2 (β2m) は定常シャペロンタンパク質です 49。小胞体に組み立てられると、HLA はペプチドリガンドの非存在下では不安定になります 50。ペプチド結合溝は、多型性が高く構造化されていない非ペプチド型のα1およびα2ドメインと、多型性が比較的低いα351ドメインによって形成されます。IFNαの存在下では、2つのHLA-A複合体が検出されました。1つはHMGA1およびH2Bと相互作用し（図5、表S3）、もう1つはMDN1、LRCH4およびH2Bと相互作用します（図6）。
IFNα は、H2B (H2BFS) および HMGA1 との HLA-A 相互作用ネットワークを誘導します。(A) H2B-HLA-A-HMGA1 複合体におけるさまざまなタイプの相互作用を示す 2D プロット (SIM-XL ソフトウェアで生成): インターリンク (青)、インターリンク (赤)、単一リンク (黒)。。異なるアイデンティティのドメインは色分けされています32: H2B (ヒストン; 2-102) および MHC-I (MHC_1; 25-203、グループ C1; 210-290 および MHC_I_C; 337-364)。クロスリンク閾値は 3.5 に設定されました。ドット プロットは、HLA-A と H2B (B) および HMGA1 (C) の相互作用部位、および 2 つのペプチド間の K または S 相互作用部位を示します。この図では、クロスリンク スコアのしきい値は 3.0 に設定されています。(D) PyMOL プログラムにおける H2B、HLA-A、および HMGA1 タンパク質の構造に示されるタンパク質間の関係。これらの構造は Phyre2 サーバー (http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2) を使用してモデル化され、H2B、HLA-A、および HMGA1 タンパク質のテンプレート構造はそれぞれ 1kx552、1kj349、および 2eze55 でした。
IFNα は、H2B (H2BFS)、MDN1、および LRCH4 との HLA-A 相互作用ネットワークを誘導します。(A) MDN1 を円で表した 2D インタラクティブ マップ (SIM-XL ソフトウェアで生成) 上に表示された分子内 (赤) および分子間 (青) 架橋。クロスリンク閾値は 3.5 に設定されました。異なるアイデンティティのドメインは色分けされています32: H2B (ヒストン; 2-102)、MHC-I (MHC_1; 25-203、グループ C1; 210-290 および MHC_I_C; 337-364)、LRCH4 (LRR_8 (68-126)、 LRR_8 (137–194) および CH (535–641))。(B) PyMOL プログラムにおける H2B、HLA-A、LRCH4、MDN1 タンパク質の構造に示されるタンパク質間の関係。これらの構造は、Phyre2 サーバー (http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2) を使用して、H2B、HLA-A、LRCH4、MDN1 タンパク質のテンプレート構造 1kx552、1kj349、6hlu62、および 6i2665 を使用してモデル化されました。それぞれ。HLA-A と H2B (C)、LRCH4 (D)、および MDN1 (E) との K または S 相互作用部位を示すドット プロット。プロットの場合、クロスリンク スコアのしきい値は 3.0 に設定されました。
ヒストン H2B は、ゲノムの完全性を維持することに加えて、転写の制御にも関与しています。H2B タンパク質は、ループと C 末端テールによって分離された 3 つのα-ヘリックスによって形成される中央ヒストン ドメイン (HFD) から構成されます 41,52。H2B との相互作用のほとんどは α1 ヘリックスで発生し、HFD ヘテロ二量体との三量体化をもたらします (図 5A、B)。溶解素は DNA 結合に関与しますが、一部の溶解素は代替のアセチル化またはメチル化部位でもあります。例えば、H2B の残基 K43、K46、および K57 は、直接の DNA 結合には関与していませんが、さまざまな転写後修飾の標的となっています 53。同様に、H2B の残基 K44、K47、および K57 は、IFNα の存在下で他のタンパク質との相互作用を含む代替の役割を果たす可能性があります (図 5A、B)。さらに、染色体外ヒストン H2B は、さまざまな細胞型で免疫応答を活性化し、感染性病原体または損傷細胞に由来する二本鎖 DNA (dsDNA) 断片を検出する細胞質センサーとして機能します 54。DNA ウイルスの存在下では、H2B の枯渇により IFN-β の産生と STAT154 のリン酸化が阻害されました。H2B は、他のコアヒストンよりも速く核内外に移動することも知られています 54。MDN1 および LRCH4 との H2B 相互作用も、選択された未処理サンプルで観察されました。我々は、3 つの IFNα 処理サンプルすべてと 1 つの未処理リピートサンプルで HLA-A が H2B と相互作用することを発見しました。これらのデータは、転写制御とは独立した代替生理学的機能における H2B の役割を反映しています。
HMGA1 (高移動性グループ AT-フック 1) は、疾患を促進するアミノ酸が豊富な小型核タンパク質であり、HLA-A と関連していることが確認されています。これは、酸性の C 末端尾部と、dsDNA の AT に富む領域の副溝に結合するため、AT フックと呼ばれる 3 つの異なる DBD を持っています55,56。この結合により DNA が曲がったりまっすぐになったりして、標準的な転写因子がそのコンセンサス配列にアクセスできるようになります。C 末端欠失変異体は転写を開始できないため、C 末端尾部はタンパク質間相互作用と転写因子の動員に関与していると考えられています57。さらに、このドメインには、キナーゼの基質として知られるいくつかの保存されたリン酸化部位が含まれています 58 。我々は、C末端ドメインの外側でHLA-AおよびH2BとHMGA1との相互作用を観察し、C末端ドメインが主に転写因子結合に使用されることを示唆しました（図5A、C）。HMGA タンパク質はアダプター DNA への結合をめぐってヒストン H1 と競合し、それによってアクセシビリティを高めます 57。同様に、HMGA はヒストン H1 と競合してリンカー DNA に沿ってヒストン H2B と相互作用すると思われます。HMGB1 は樹状細胞において HLA-A、-B、および -C の発現を誘導し、それらの活性化をもたらします 59 が、HMG と HLA の間の相互作用はこれまで報告されていませんでした。我々は、HMGA1がHLA-Aのα1およびα3ドメインと相互作用し、相互作用のほとんどがその3 DBDの外側で行われることを発見しました（図5A、C）。我々の研究では、HLA-A は核内に局在していることが判明し (データは示されていません)、H2B と HMGA1 も核内に存在することを考えると、この相互作用は核内で発生する可能性があります。H2B、HLA-A、および HMGA1 の間で測定された特定の付加物を図 5D に示します。
HLA-A と他のタンパク質との相互作用のほとんどは、その α1 および α2 ドメインと無秩序な C 末端ドメイン内で発生します (図 6)。これらの例の 1 つでは、HLA-A が LRCH4 の無秩序な N 末端テールと相互作用することを発見しました (図 6A、D)。LRCH4 は TLR4 の活性化と LPS サイトカインの誘導を調節し、それによって自然免疫応答を調節します 60,61。これは、細胞外ドメインに 9 つのロイシンリッチリピート (LRR) とカルモジュリン (CH) 相同モチーフを持ち、その後に膜貫通ドメイン (TMD) が続く膜タンパク質です 60、62。CH ドメインはタンパク質間相互作用を媒介することが報告されています 60 。LRR ドメインと CH ドメイン間の約 300 アミノ酸のストレッチは比較的アクセスしやすいですが、無秩序です。タンパク質間ネットワークおよび小胞輸送のメディエーターとしての無秩序な領域の機能に基づいて、我々は、ほとんどのタンパク質相互作用が無秩序な領域で起こることを発見した。MDN1との相互作用は、LRR1、LRR6、CHドメイン、ランダム領域を含むタンパク質の長さ全体に分布していましたが、H2Bは主にCHドメインに結合しました（図6A、B）。注目すべきことに、相互作用には顎関節が含まれておらず、CLMS アプローチの特異性が示唆されています (図 6A、B)。
MDN1 は、HLA-A タンパク質ネットワークの一部としても特定されています (図 6A)。これは、AAA ファミリーのタンパク質 (さまざまな活性に関連する ATPase) に属します。これは、六量体リングを構成し、60S 64 リボソーム サブユニットから集合因子を除去する同じ N 末端 AAA ドメインです。dynein64、65、66 に似ているようです。さらに、Asp/Glu リッチ領域の後には MIDAS ドメイン (金属イオン依存部位) が続きます。MDN1 はサイズが大きい (約 5600 アミノ酸) こと、およびよく研究されているタンパク質との相同性が限られているため、ヒトにおけるその構造と機能についてはほとんどわかっていません。我々は、HLA-A、H2B、およびLRCH4をMDN1結合パートナーとして同定し、PyMolにおけるタンパク質複合体としてのそれらの配向を明らかにした（図6A、B）。これら 3 つのタンパク質は、AAA ドメイン、ダイニン様リンカー ドメイン、およびおそらく MIDAS MDN1 ドメインと相互作用します。以前の報告では、ベイトタンパク質のアフィニティー精製により、MDN1 がヒストン H2B67 に関連するタンパク質として同定されました。さらに、最近の研究では、アフィニティー精製質量分析法を使用した HCT116 細胞における MDN と HLA-B 間の相互作用も報告されており、我々の発見を裏付けています 68。IFNα処理サンプルにおけるこの複合体の同定は、インターフェロンシグナル伝達におけるMDN1の役割を示唆しています。
HLA 遺伝子は多型性が高いため、Flo-1 細胞の RNA シーケンス データから HLA-A、-B、および -C をマッピングするシーケンス リードを抽出しました (データは示されていません)。配列決定の読み取りと一致するペプチド配列により、HLA-A の架橋ペプチドが位置する領域における HLA-A、-B、および -C 間の有意な違いが明らかになりました (図 S3)。さらに、HLA-B/C 分子と H2B/HMGA1/MDN1/LRCH4 タンパク質とのタンパク質間架橋は観察されませんでした。これは、HLA-A、MDN1、LRCH1、および HMGA1 の間に見られるタンパク質相互作用が HLA-A 特異的であることを示唆しています。さらに、非架橋サンプルのプロテオミクス分析 (表 S4) では、HLA-A が HLA-B または HLA-C と比較して配列範囲が高いことが示されました。HLA-A について同定されたペプチドは、IFNα 処理サンプルと未処理サンプルの両方で強度が高かった。
ここで特定された相互作用が、空間的に近接した 2 つのタンパク質の非特異的架橋によるものではないことを確認するために、免疫共沈降アッセイを実行することにより、2 つの新しい HLA-A 相互作用因子をさらに確認しました。HLA-A と内在性 MDN1 および H2B との相互作用は、IFNα 処理および未処理の Flo-1 細胞の両方で検出されました (図 7、図 S4)。未処理細胞からの免疫沈降物サンプルには HLA-A が存在しないため、HLA-A が免疫沈降物中の H2B によって捕捉され、この関連性が IFNα 処理によるものであることを確認しました (図 7A)。しかし、我々のデータは、IFNαがHLA-AのH2BおよびMDN1への結合を異なって調節していることを示唆している。IFNαは、H2BとHLA-A間の会合を誘導しますが、MDN1との会合を減少させます。我々は、対照においてMDN1がHLA-Aと関連しており、IFNαの添加により、IFNαによるMDN1の誘導とは独立してこの相互作用が減少することを発見した(図7B、C)。さらに、HLA-A 免疫沈降により A549 細胞の H2B が捕捉されました (図 S4)。これは、この相互作用が細胞型に依存しないことを示唆しています。総合すると、これらの結果は、インターフェロンを介した HLA-A と H2B および MDN1 の相互作用を裏付けます。
HLA-A は H2B と MDN1 を同時精製します。代表的な内因性 H2B (A) および MDN1 (B) 免疫ブロットを IFNα 処理 Flo-1 細胞から免疫沈降し、示された抗体についてプローブしました。マウスおよびウサギの IgG をネガティブコントロールとして使用しました。(C) 異なる抗原の相対量 (入力) は、示された抗体に対してプローブされた免疫ブロットによって示されます。β-アクチンはローディング コントロールとして使用されました。
インターフェロン誘導性の信頼性の高い架橋ネットワークの 1 つである H2B-HLA-A-HMGA1 の構造特性が研究されました。私たちは、この複合体に関与するタンパク質の立体構造動力学を理解するための代替アプローチとして分子動力学モデリングを使用しました (図 8)。CLMS データからの推論は、H2B、HLA-A、および HMGA1 タンパク質の異なる立体構造の可能性を示唆しています。したがって、次の潜在的な複合体を溶媒中でモデル化しました: H2B-HLA-A、HMGA1-HLA-A、および H2B-HLA-A-HMGA1。MOE（分子動作環境; Chemical Computing Group Inc.、モントリオール、ケベック、カナダ）パッケージを使用した最初のタンパク質間ドッキングスクリーニングにより、これらのタンパク質間で異なる立体構造の可能性が示唆されました（図8A）。ドッキングタンパク質複合体の視覚化により、いくつかの相互作用と考えられる立体構造が明らかになりました (図 5A、8)。したがって、考えられる 1 つの立体構造が図 8A (標識されたクロスリンク付き) に示されており、MD モデリング パイプラインを使用してさらに評価されました。さらに、H2BまたはHMGA1のHLA-Aへの結合は、HLA-Aに対するH2Bのより高い親和性を強調する(図8A)。
H2B (H2BFS)-HLA-A、HMGA1-HLA-A、および H2B-HLA-A-HMGA1 複合体間の可能なネットワークの立体配座ダイナミクス。(A) 左のパネルは、分子内 (赤) および分子間 (青) 架橋の 2D マップ (SIM-XL ソフトウェアで生成) (架橋カットオフは 3.5 に設定) です。さらに、同定された架橋残基は、H2B、HLA-A、および HMGA1 タンパク質の構造上で標識されます。これらのタンパク質の関連立体構造は、MOE パッケージに実装されたドッキング パイプラインを使用して抽出されました。左下のパネルは、異なるタンパク質間結合親和性 (GBVI/WSA dG; kcal/mol) を持つ H2B-HLA-A および HMGA1-HLA-A 複合体の考えられるさまざまな立体構造を示しています。(B) 各タンパク質構造の原子位置 (水素原子を除く) の標準偏差 (RMSD)。(C) 継続時間 ≥ 10 ns の特定の相互作用を考慮した、さまざまなシミュレートされた複合体からの分子間タンパク質間水素結合相互作用。H結合ドナー-アクセプターのカットオフ距離は3.5Åに設定され、ドナー-H-アクセプターのカットオフ角度は≥160°〜180°に設定されました。(D) ダミー HLA-A-H2B および HLA-A-HMGA1 複合体から抽出された、20 ns 以上にわたる、それぞれのパートナーとの HLA-A タンパク質間相互作用を形成する標識残基。タンパク質構造は、100 ns MDS の平均構造を表します。(E) HLA-A-H2B 複合体と HLA-A-HMGA1 複合体間の相互作用を、2 つのペプチド間の K または S 相互作用部位に基づいて 100 ns にわたる H2B-HLA シミュレーションによって追跡した相互作用と比較します。複合体 /HMGA1-HLA-A/H2B-HLA-A-HMGA1。クロスリンクの評価の閾値は 3.0 に設定され、10 ns 以上の MDS からの特異的な相互作用が考慮されました。タンパク質構造は、BIOVIA Discovery Studio (Dassault Systèmes、BIOVIA Corp.、サンディエゴ、カリフォルニア州、米国) および分子オペレーティング環境 (MOE; Chemical Computing Group Inc.、モントリオール、ケベック、カナダ) パッケージを使用して視覚化しました。
HLA-A 分子の経時的な安定性 (標準偏差; RMSD または標準偏差; RMSF) は、複合体中の H2B または HMGA1 タンパク質の存在が HLA-A を安定化することを示しました (図 8B、図 S5)。HMGA1 タンパク質は HLA-A の B2M 部位にしっかりと結合し、HLA-A-HMGA1 または H2B-HLA-A-HMGA1 複合体における HLA-A アミノ酸の安定性を誘導します (図 8B、図 S5)。特に、HLA残基〜60〜90および〜180〜210は、H2Bの存在下では柔軟性が低いことが判明した(図8B)。H2B および HMGA1 は、H2B または HMGA1 単独への HLA-A 結合と比較して、H2B-HLA-A-HMGA1 複合体における HLA-A へのより良い結合を示しました（図 8C、D; 表 S5）。水素結合に関与する残基 (MD モデルによる高占有率 ≥ 10 ns) は、複合体の CLMS 相互作用部位 (K または S 残基) と一致しており、CLMS によって同定された相互作用が非常に信頼できることを示唆しています。信頼性（図８Ｅ）。ＣＬＭＳおよびＭＤモデリングにおいて、約１９０〜２１０アミノ酸と約２００〜２２０アミノ酸の間のＨＬＡ−Ａ残基が、それぞれＨ２ＢおよびＨＭＧＡ１に結合することが見出された（図８Ｅ）。
タンパク質間の相互作用は、特定の刺激に応答して細胞内コミュニケーションを媒介する動的構造ネットワークを形成します。多くのプロテオミクス手法はタンパク質全体の定常状態レベルの変化を検出するため、タンパク質間相互作用ダイナミクスでは結合界面を捕捉するための追加ツールが必要であり、CLMS はそのようなツールの 1 つです。インターフェロンシグナル伝達システムは、細胞がさまざまな環境病原性および固有の病理学的シグナルに応答できるようにするサイトカインネットワークであり、最終的にはインターフェロン誘導性タンパク質のサブセットの誘導に至ります。我々は CLMS を適用して、インターフェロン誘導性タンパク質のパネル間で新規のタンパク質間相互作用を同定できるかどうかを判定しました。インターフェロン応答性 Flo-1 細胞モデルにおける全体的なタンパク質架橋分析を使用して、タンパク質複合体を捕捉しました。非架橋細胞および架橋細胞からトリプシンペプチドを抽出すると、ペプチドの計数、経路の濃縮、および定義された LFQ 強度でのペプチド長分布が可能になります。正規のインターフェロン誘導性タンパク質が陽性内部対照として同定される一方、MX1、UP18、OAS3、STAT1 などの正規のインターフェロン誘導性タンパク質の新しい分子間および分子内架橋付加体が観察されました。機能領域におけるさまざまな構造的特徴と相互作用が研究されています。
HLA-A、MDN1、および H2B の間の相互作用は、IFNα で処理したおよび未処理の Flo-1 細胞および A549 細胞におけるイムノブロッティングによって検出されました。我々の結果は、HLA-AがIFNα依存的にH2Bと複合体を形成することを強調しています。私たちの研究は、これら 2 つの複合体の共局在をさらに探求するための興味深い手段となります。CLMS アプローチを細胞株のパネルに拡張して、細胞の種類に依存しないインターフェロン媒介タンパク質相互作用を同定することも興味深いでしょう。最後に、H2BFS-HLA-A-HMGA1 複合体に関与するタンパク質の立体構造動態を理解するための代替アプローチとして MD モデリングを使用し、分子内および分子間のクロストークを追跡しました。CLMS データからの推論は、H2BFS、HLA-A、および HMGA1 タンパク質の異なる立体構造の可能性を示唆しています。これらのドッキングタンパク質複合体間の異なる立体構造の可能性により、CLMS データセットで観察されたものと同様のいくつかの相互作用が明らかになりました。私たちの方法の主な強みの1つは、HLAなどの相互作用する高度に多型性の遺伝子を簡単に同定できることであるため、他の方法では研究が難しいHLAハプロタイプ特異的タンパク質の相互作用を研究することは興味深いでしょう。まとめると、我々のデータは、CLMS を使用してインターフェロン誘導性シグナル伝達ネットワークの理解を拡大し、腫瘍微小環境におけるより複雑な細胞間システムを研究するための基礎を提供できることを示しています。
Flo-1 細胞は ATCC から入手し、1% ペニシリン/ストレプトマイシン (Invitrogen)、10% ウシ胎児血清 (Gibco) を補充した DMEM (Gibco) で維持し、37℃、5% CO2 で保存しました。インキュベーション。細胞を70～80%コンフルエンスまで増殖させた後、IFNα14(Edinburgh Protein Production Facilityにより製造)で処理した。他のすべての化学物質および試薬は、特に断りのない限り、Sigma Aldrich から購入しました。
Flo-1細胞を6ウェルプレートで培養し、翌日、細胞を10ng/mlのIFNα14で24時間処理して約80%コンフルエントにした。細胞をＰＢＳで３回洗浄し、ＰＢＳ中の新たに調製したＤＳＳ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）（ＤＭＳＯに溶解）と３７℃で５分間、最終濃度０．５ｍＭまでライゲーションした。DSS架橋反応をPBSで置換し、PBS中の20mM Tris(pH8.0)を37℃で15分間添加することによって残留DSSをクエンチした。細胞を掻き取ることによって収集し、低結合チューブ（Axygen）に収集した。
細胞ペレットを、３００μｌの尿素溶解緩衝液（８Ｍ尿素、０．１Ｍトリス、ｐＨ８．５）を用いて室温で３０分間、時折振盪しながら溶解した。すべての遠心分離ステップは 8℃、14,000 xg で実行されました。ライセートを 10 分間遠心分離し、上清を新しいチューブに移します。残りの透明な粒子を、均質な水溶液が得られるまで３０分間以上、第２の溶解緩衝液（２Ｍ尿素、２％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム））１５０μｌに溶解した。ライセートを 20 分間遠心分離し、上清を前のステップで得たライセートと混合しました。タンパク質濃度は、マイクロプレート手順に関する製造業者の指示に従って、Micro BCA アッセイ (Thermo Fisher Scientific) を使用して評価しました。サンプルは液体窒素中で急速凍結され、-80℃で保存されました。
約 100 μg の可溶性架橋タンパク質を、Wisniewski et al. によって記載されている修正濾過サンプル調製プロトコール (FASP) を使用して処理しました。69 簡単に説明すると、タンパク質を 200 μl の尿素緩衝液 (0.1 M トリス中 8 M 尿素、pH 8.5) で架橋し、ボルテックスして半分にします。すべての遠心分離ステップは 25℃、14,000 xg で実行されました。架橋タンパク質溶解物の前半を、Ultracel-10膜(Merck)を備えた10kDa Microcon遠心フィルター装置に移し、続いてフィルター上で25分間遠心分離した。次に、タンパク質の後半をフィルターに追加し、同じ手順を繰り返します。タンパク質の回収は、尿素緩衝液中の17 mM トリス(2-カルボキシエチル)ホスフィン塩酸塩(TCEP) 100μlを添加することによって実施した。回収物をサーモミキサー上で６００ｒｐｍ、３７℃で３０分間撹拌した。さらに、カラムを遠心分離し、尿素緩衝液中の50mMヨードアセトアミド100μlを使用して、還元された架橋タンパク質をアルキル化した。アルキル化反応は、室温、暗所で２０分間実施した。カラムを回転させ、100 µl 尿素緩衝液でカラム壁を 3 回洗浄し、遠心分離します。１００ｍＭ重炭酸アンモニウム１００μｌを用いて同様の操作を３回行った。トリプシン処理の前に、コレクションチューブを新しいものと交換してください。50 mM 重炭酸アンモニウムとトリプシン緩衝液 (Promega) で希釈した 1 μl トリプシンを含む消化緩衝液を加えます。トリプシン対タンパク質の比率を約1:33に維持し、消化反応物を湿潤チャンバー内で37℃で一晩インキュベートした。架橋ペプチドを２５分間の遠心分離によりフィルターから溶出した。50μlの0.5M NaClをフィルターに添加し、続いて25分間遠心分離することにより、ペプチドの回収率が向上した。
C18 Micro Spin カラム (Harvard Apparatus) を使用して、Bouchal et al.70 に記載されているプロトコールに従って若干の変更を加えて架橋トリプシンペプチドを脱塩しました。簡単に説明すると、C18 スピンカラムを、アセトニトリル (AcN) (Merck) 中の 0.1% ギ酸 (FA) で 3 回洗浄し、0.1% FA で 2 回洗浄して活性化しました。カラムを０．１％ＦＡで１５分間水和した。サンプルをスピンカラムにロードし、0.1% FA で 3 回洗浄します。脱塩ペプチドを、0.1% FA中の50%、80%、および100% AcNを使用して段階的勾配で連続的に溶出した。残留液体が完全になくなるまで、サンプルを SpeedVac Plus 濃縮装置 (Eppendorf) で乾燥させました。溶出したペプチドを2.5% AcN中の0.08% トリフルオロ酢酸100μlに溶解し、濃度をNanoDrop 2000 (Thermo Scientific)で測定した。サンプルあたり約 1 μg の架橋ペプチドを LC-MS/MS システムに注入しました。
架橋ペプチドは、Orbitrap Exploris 480 質量分析計 (Thermo Scientific) に接続された UltiMate 3000 RSLCnano LC システム (Thermo Scientific) で分離されました。架橋ペプチドは、C18 PepMap100 吸着剤および 5 µm PepMap 吸着剤 (Thermo Scientific) が充填された内径 300 µm、長さ 5 mm のμプレカラム C18 キャプチャ カラム上に収集されました。2.5% AcN に溶解した 0.08% トリフルオロ酢酸を 5 μl/min に設定したポンプ流量をロードします。架橋ペプチドは、2 μm PepMap 吸着剤 (Thermo Scientific) を充填した内径 75 μm、長さ 150 mm の分析用溶融シリカカラムで分離しました。移動相 A および B は、それぞれ 0.1% FA 水溶液と 0.1% FA アセトニトリル溶液で構成されていました。勾配は 2.5% B で始まり、90 分間で 40% B まで直線的に増加し、次の 2 分間で 90% B まで増加します。移動相組成は 90% B に 10 分間維持され、その後 2 分間で 2.5% B まで直線的に減少しました。次のサイクルの前に、カラムを 2.5% B で 8 分間平衡化しました。分析カラムから溶出された架橋ペプチドは、ナノエレクトロスプレーイオン化 (NSI) 源でイオン化され、Exploris 480 質量分析計 (Thermo Scientific) に注入されました。
Orbitrap Exploris 480 質量分析計は、正のデータ相関モードで動作しました。フルスキャンは、m/z 350 Th から m/z 2000 Th までの範囲設定で、解像度 120,000 のセクション モードで実行されました。正規化された AGC ターゲットは、最大入力時間 50ms で 300% に設定されました。ペプチドのモノアイソトピックピーク検出が確立されています。検出されたプリカーサーが少なすぎる場合、制約緩和パラメーターは true に設定されます。前駆体の最小イオン強度は 5.0e3 に設定され、最大 +8 までの前駆体の電荷状態が実験に含まれました。
データ相関モードでのメジャー スキャン間のサイクル タイムは 2.5 秒に設定されました。動的質量排除は、前駆体イオンの最初のフラグメンテーション後 20 秒に設定されました。前駆体分離ウィンドウは 2 Th に設定されました。固定衝突エネルギー モードを使用した正規化衝突エネルギーのタイプは、データ依存の MS/MS スキャンで選択されました。衝突エネルギーは 30% に設定されています。Orbitrap 解像度は 15,000 に設定され、AGC ターゲットは 100% に設定されました。カスタム最大注入時間は 60 ミリ秒に設定されています。
架橋サンプル中のタンパク質間ネットワークを追跡する前に、MaxQuant パッケージ (バージョン 1.6.12.0) 26,27 を使用して生ファイルを処理し、サンプル中の追跡可能なペプチド/タンパク質を特定しました。さらに、同様のプロテオミクス分析を、IFNα で処理した非架橋 Flo-1 サンプルと未処理の Flo-1 サンプルに対して実行しました。MS/MS データは、内蔵の検索エンジン Andromeda27 を使用して、UniProt ヒト データベース (www.uniprot.org) (2020 年 8 月 12 日にアップロード、75,093 のエントリを含む) で検索されました。検索は、酵素の特異性および脱アミド化 (N、Q) および酸化 (M) のさまざまな修飾を示さずに実行されました。前駆体の質量許容差は 20 ppm、プロダクト イオンは 0.02 Da に設定されました。初期および最大質量偏差は 10 ppm に設定されました。ペプチドの最大質量は 4600 Da に設定され、配列類似性は 7 ～ 25 アミノ酸 (aa) の間に設定されました。さらなる統計分析は、Perseus プログラム (バージョン 1.6.10.45) を使用して実行されました。タンパク質含有量は、タンパク質のスペクトル強度（LFQ強度;非標識定量化）27を正規化することによって計算され、強度値はLog2に変換されました。ペプチド強度によって識別されるタンパク質の階層的クラスタリングは、R (v 4.1.2) の pheatmap (v1.0.12) パッケージを使用して構築されました。Reactome 経路データベースを使用して、未処理サンプルと比較して 4 倍以上活性化された IFNα 処理タンパク質の経路濃縮分析を実行しました。
LC-MS/MS によってモニタリングされるタンパク質複合体のリジン (K) またはセリン (S) 特異的な化学架橋の同定は、架橋ペプチド用分光同定装置 (SIM-XL) を使用して実行されました (SIM-XL)29。まず、インターフェロン関連 (IFN) DNA 損傷耐性サイン (IRDS) 遺伝子間の相互作用の可能性が、Padariya et al.28 に記載されている IRDS タンパク質データセットを使用して調査されました。ヒト UniProt 全体のすべての条件とリピートをスクリーニングすることは計算量が多いため、ヒト UniProt データベース (www.uniprot.org) (2020 年 8 月 12 日にダウンロード、75,093 エントリを含む) 全体を IFNα 処理リピートに対してスクリーニングします。信頼性の高いインタラクションのためのフィルターの 1 つ。得られたこれらの有意性の高い相互作用は、すべての繰り返しと条件で拡張およびテストされました。
SIM-XL では、架橋剤 (XL) に DSS を使用し、XL 重量シフトと修飾重量シフトをそれぞれ 138.06 と 156.07 に設定しました。次の架橋反応部位が考慮されます: KK、KS、および KN-TERM (レポーター イオンなし)。プリカーサーとフラグメントの両方の ppm を 20 に設定し、Xrea 閾値を 0.15 に設定しました。トリプシンは完全に特異的であると考えられ、高エネルギー C トラップ (HCD) 断片化法が実装されました。XCorr 動的 DB 削減閾値と動的 DB 削減のペプチドの最小数は、それぞれ 2.5 と 2 に設定されました。他のパラメーターは、モノアイソトープ確率とピーク同時発生カットオフ、鎖あたり最小 4 個の AA 残基と最大鎖電荷、およびミス スプリットの最大 3 つです。結果として得られたステッチされた 2D マップは (SIM-XL) で分析され、xQuest28 グラフィック表現を使用して 2D マップが構築されました。タンパク質構造上のタンパク質架橋は、PyMol (PyMOL Molecular Graphics System、バージョン 2.0 Schrödinger, LLC) で提供されます。
タンパク質モデル構造は、相同性モデリングの原理と「隠れマルコフ法」の実装を使用して、Phyre2 サーバー (http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2)11 を使用して作成されました。Phyre2 は、既知のタンパク質構造との配列アラインメントに基づいてモデル構造を生成します。H2BFS、HLA-A、HMGA1、LRCH4、および MDN1 タンパク質の場合、テンプレート構造 1kx552、1kj349、2eze55、6hlu62、および 6i2665 を使用しました。さらに、AlphaFold71 MX1、UBP18、ROBO1 の構造も考慮されました。タンパク質の構造は、BIOVIA Discovery Studio Visualizer パッケージ (Dassault Systèmes、BIOVIA、サンディエゴ、カリフォルニア州、米国) および分子オペレーティング環境パッケージ (MOE、Chemical Computing Group Inc.、モントリオール、ケベック、カナダ) を使用して視覚化されました。